Serological evaluation for detection of anti-Leishmania antibodies in dogs and cats in the district of Santa Rita de Cássia, municipality of Barra Mansa, State of Rio de Janeiro

Abstract

From a canine case of american cutaneous leishmaniasis in the locality of Santa Rita de Cássia, municipality of Barra Mansa, Rio de Janeiro, a serological survey was performed on 177 dogs and 43 cats. Evaluation of the canine serum samples showed that 10% had a positive reaction in the indirect immunofluorescence test and 10.7% in the enzyme-linked immunosorbent assay. Among the feline serum samples tested, none of the animals had a positive reaction in the indirect immunofluorescence test and only one (2.4%) showed a positive reaction in the enzyme-linked immunosorbent assay. The detection of an autochthonous case of Leishmania braziliensis in Barra Mansa gives warning that a focus of american cutaneous leishmaniasis is possibly becoming established in this region.

Avaliação sorológica para detecção de anticorpos anti-Leishmania em cães e gatos no bairro de Santa Rita de Cássia, Município de Barra Mansa, Estado do Rio de Janeiro

Serological evaluation for detection of anti-Leishmania antibodies in dogs and cats in the district of Santa Rita de Cássia, municipality of Barra Mansa, State of Rio de Janeiro

Fabiano Borges FigueiredoI; Isabel Cristina Fábregas BonnaII; Lílian Dias NascimentoIII; Tatiana da CostaII; Cibele BaptistaIII; Tânia Maria Valente PachecoI; Maria Regina Reis AmendoeiraII; Maria de Fátima MadeiraIII

ILaboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em animais domésticos, Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ

IILaboratório de Toxoplasmose, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ

IIILaboratório de Vigilância em Leishmanioses, Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ

Endereço para correspondência

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RESUMO

A partir de um caso canino de leishmaniose tegumentar americana na localidade de Santa Rita de Cássia, município de Barra Mansa, Rio de Janeiro, foi realizado um inquérito sorológico em 177 cães e 43 gatos. Na avaliação das amostras de soros caninos, 10% foram positivos na reação de imunofluorescência indireta e 10,7% no ensaio imunoenzimático. Entre as amostras de soros felinos testados, nenhum animal foi positivo na reação de imunofluorescência indireta e apenas um (2,4%) felino apresentou reação positiva ao ensaio imunoenzimático. A detecção de Leishmania braziliensis, autóctone em Barra Mansa, faz um alerta para a instalação de um possível foco de leishmaniose tegumentar americana nessa região.

Palavras-chaves: Leishmaniose tegumentar americana. Diagnóstico. Sorologia. Cães e gatos. Barra Mansa.

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ABSTRACT

From a canine case of american cutaneous leishmaniasis in the locality of Santa Rita de Cássia, municipality of Barra Mansa, Rio de Janeiro, a serological survey was performed on 177 dogs and 43 cats. Evaluation of the canine serum samples showed that 10% had a positive reaction in the indirect immunofluorescence test and 10.7% in the enzyme-linked immunosorbent assay. Among the feline serum samples tested, none of the animals had a positive reaction in the indirect immunofluorescence test and only one (2.4%) showed a positive reaction in the enzyme-linked immunosorbent assay. The detection of an autochthonous case of Leishmania braziliensis in Barra Mansa gives warning that a focus of american cutaneous leishmaniasis is possibly becoming established in this region.

Key-words: American cutaneous leishmaniasis. Diagnosis. Serology. Dogs and cats. Barra Mansa.

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As leishmanioses são zoonoses que acometem o homem e outras espécies de mamíferos silvestres e domésticos, de forma crônica com diversas manifestações clínicas. São causadas por protozoários do gênero Leishmania cuja transmissão ocorre através da picada de insetos vetores da subfamília Phlebotominae8 16.

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) constitui um grave problema de saúde pública podendo ocasionar deformidades destrutivas e por vezes incapacitantes. No Brasil, apresenta ampla distribuição geográfica, sendo que o número de casos vem aumentando progressivamente com uma média anual de 35 mil indivíduos infectados nos últimos 20 anos12 22.

Leishmania (Viannia) braziliensis constitui um dos agentes etiológicos da LTA, cujo ciclo em ambiente urbano apresenta um perfil de transmissão no intra e no peridomicílio, condicionado à adaptação de algumas espécies de flebotomíneos ao meio ambiente da periferia das cidades, atingido também mulheres e crianças6 9 16 25. Neste contexto, é importante ressaltar a presença de hospedeiros domésticos como cães, felinos e eqüinos, criando a possibilidade, ainda não comprovada, desses animais atuarem como reservatórios e amplificadores de ciclos instalados no peridomicílio10 16.

No Estado do Rio de Janeiro, a ocorrência da LTA é assinalada em diferentes municípios desde o início do século XX9. Embora seja difícil comprovar a autoctonia dos casos nessa época, diversos outros surtos foram também descritos, denotando a expansão da LTA para outras regiões do estado2 19 23 31. O processo migratório aliado ao tipo de ocupação do solo, provocando situações de desordem ambiental, foi por diversas vezes associado ao aparecimento de novos casos de LTA no Rio de Janeiro13 16.

Durante um estudo no bairro de Santa Rita de Cássia, Barra Mansa (RJ) foi encontrado um cão naturalmente infectado por Leishmania sp., motivando este trabalho, através da busca ativa de possíveis outros casos em cães e gatos da região.

MATERIAL E MÉTODOS

O bairro de Santa Rita de Cássia está situado no município de Barra Mansa, região rural do Estado do Rio de Janeiro, cuja base da economia é a horticultura. A região se localiza na latitude de 22º29"34', 46 S e longitude de 44º09"56', 30 W, próximo à Serra das Araras e faz limite com o município de Volta Redonda (Figura 1).

Segundo a Secretaria Municipal de Saúde de Barra Mansa (SMS/BM) a população humana é de 1300 habitantes, com uma parte flutuante formada por pessoas que chegam à região para prestar serviços.

Entre os meses de julho e dezembro de 2005 foi realizada busca ativa de cães e gatos no bairro periférico de Santa Rita de Cássia, Barra Mansa, RJ. Durante as visitas domiciliares, os responsáveis pelos animais foram esclarecidos sobre o estudo e autorizaram a coleta de espécimes clínicos dos animais, assim como a utilização dos dados da pesquisa, através de um termo de consentimento. Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Fundação Oswaldo Cruz (CEUA/FIOCRUZ, P-0280/06). Como não havia informação prévia oficial sobre o número da população animal foi realizado um censo, com visitas em todas as residências da região.

Os animais foram contidos fisicamente para a coleta de sangue e exame clínico. Nos cães de grande porte foi puncionada a veia cefálica e em felinos e cães de médio e pequeno porte a veia de escolha foi a jugular. De cada animal foram coletados 5mL de sangue e acondicionados em tubos estéreis (BD-Vacutainer) para posterior realização dos testes sorológicos. Após estes procedimentos, todos os animais foram submetidos ao exame clínico e dermatológico, buscando evidenciar a presença de lesões cutâneas e mucosas sugestivas de LTA.

O teste de imunofluorescência indireta (IFI) para a pesquisa de anticorpos caninos anti-Leishmania foi realizada segundo a descrição do kit de IFI para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina (Bio-Manguinhos/FIOCRUZ). Considerou-se positivas as amostras que apresentaram fluorescência em diluições iguais ou superiores a 1:40. Para o teste imunoenzimático (ELISA), utilizou-se a pesquisa de imunoglobulinas da classe G (IgG) específicas para antígenos obtidos de formas promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis (MHOM/BR/75/M2903).Os soros foram diluídos a 1:40 em duplicata e o ponto de corte (cut-off) foi estabelecido pela média das leituras dos controles negativos mais duas vezes o desvio padrão dos mesmos. Valores até 20% do cut-off foram considerados indeterminados e a positividade baseou-se em leituras superiores a esse valor.

Na avaliação sorológica felina, formas promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis foram utilizadas como antígeno tanto para a IFI quanto para o ELISA. Na IFI, os soros foram diluídos a partir de 1:40 e o conjugado (Goat anti-cat IgG Fc fragment FITC, A20-117F, Bethyl Laboratory Inc., Montogomery, TX) diluído a 1:50 em salina tamponada com fosfatos (PBS) com 1:25 de Azul de Evans. Títulos iguais ou superiores a 1:40 foram considerados positivos. Para o ELISA, placas de poliestireno de 96 poços (Nunc Maxisorp, Nalgene Nunc International, Rochester, NY) foram sensibilizadas com o antígeno total parcialmente solúvel de Leishmania (Viannia) braziliensis. As amostras de soro foram diluídas a 1:40 e o conjugado (Goat anti-cat IgG Fc HRP) (A20-117P, Bethyl Laboratory Inc., Montogomery, TX) a 1:40.000. A determinação da positividade foi semelhante ao obtido no mesmo teste para os cães. No soro dos felinos foi realizado também o teste de ELISA rápido para detecção de antígenos do vírus da leucemia felina (FeLV) e anticorpos anti o vírus da imunodeficiência felina (FIV) (SNAP Combo FeLVAg/FIVAb, IDEXX, Wesbrook, Mass). A técnica foi realizada de acordo com as instruções do fabricante.

No cão que apresentava lesão sugestiva, foi realizada biópsia visando o isolamento parasitário. Para este procedimento, o animal foi sedado por via intramuscular com acepromazina (0,1-0,2mg/kg) e quetamina (10mg/kg) e anestesiado no local da biópsia com lidocaína 2%. Fragmentos obtidos do bordo da lesão foram conservados em solução fisiológica contendo 1.200UI de penicilina; 1.000ug de estreptomicina e 100ug de 5' fluorocitosina por mililitro e após 24 horas foram semeados em meio de cultura bifásico NNN (Novy, MacNeal, Nicolle)/Schneider suplementado com 10% de soro fetal bovino. Os tubos foram incubados a temperatura de 26-28ºC e examinados semanalmente. Os isolados obtidos foram caracterizados pela eletroforese de enzimas utilizando protocolos já definidos7.

RESULTADOS

No período do estudo, foram avaliados 177 cães (68 machos e 109 fêmeas) e 43 gatos (26 machos e 17 fêmeas). Dos soros caninos testados pela técnica de IFI, 10% apresentaram reatividade sorológica com os seguintes títulos: 1:40 (5,6%); 1:80 (3,4%); 1:160 (0,6%) e 1:320 (0,6%) e pelo teste de ELISA, 10,7% foram sororreatores e 5,6% apresentaram reações indeterminadas. Entre os felinos avaliados, nenhum animal foi considerado reator à IFI; entretanto, ao ELISA, 2,4% apresentaram reatividade e 4,8% mostraram resultados indeterminados. No exame sorológico, para detecção dos vírus da leucemia felina e da imunodeficiência felina, todos os animais apresentaram resultados negativos.

Dos 220 animais avaliados dermatologicamente, apenas um cão apresentou uma lesão ulcerada na região da bolsa escrotal (Figura 2), cujo exame parasitológico possibilitou o isolamento de formas promastigotas em cultura, identificadas posteriormente, por isoenzimas como Leishmania (Viannia) braziliensis (Figura 3).

DISCUSSÃO

O exame sorológico através das técnicas de IFI e ELISA já é consolidado em inquéritos caninos, para a detecção da leishmaniose visceral apresentando altas taxas de sensibilidade e especificidade21 24. Entretanto, os resultados dessas metodologias relacionados a forma cutânea da doença são discordantes.

Em infecções humanas por Leishmania (Viannia) braziliensis é descrito que a resposta imune é predominantemente celular, determinando assim fraca resposta humoral e baixa quantidade de anticorpos séricos detectáveis pelos métodos tradicionais1.

Uchoa cols33 sugerem que mesmo em cães as técnicas sorológicas devam ser utilizadas associadas a outros parâmetros ou então para definições de diagnósticos diferenciais da LTA. Já em outro estudo realizado em cães de área endêmica no Rio de Janeiro, mostrou que a detecção de anticorpos específicos, através dos testes sorológicos como a IFI e ELISA, apresentou maior sensibilidade e especificidade quando comparados ao exame clínico e a demonstração do parasita no exame direto3. Associado a este achado Silveira cols32 e Zanzarini cols35 relataram que em comparação com a técnica de IFI, o esfregaço por aposição não constitui um processo ideal de diagnóstico para LTA, devido ao baixo número de parasitas presentes nas lesões desses animais. Em nosso estudo, embora 220 animais tenham sido cuidadosamente examinados, o parasita foi constatado em apenas um cão, que apresentou reatividade para ambos os testes sorológicos com o título de 1:320 na IFI.

A prevalência sorológica canina encontrada neste estudo foi semelhante à encontrada em outras áreas endêmicas de LTA11 28. Outro resultado importante foi o encontro de cães sorologicamente positivos sem a presença de lesões o que reforça o relato de Marzochi e Barbosa-Santos em 1988, os quais sugerem a existência de animais infectados por Leishmania sem a presença deste sinal clínico15. Estes resultados fazem um alerta para a possível instalação de um surto na região.

Com relação aos valores das titulações encontradas na IFI, 94,4% (n=178) dos cães apresentaram títulos iguais ou inferiores a 1:160, resultado esse que se assemelha ao descrito na literatura3 17 32.

Na comparação entre as técnicas de IFI e ELISA, os resultados mostraram percentuais similares, diferenciando dos achados de Uchoa cols33 onde 24,5% dos animais (n=261) apresentaram reatividade no ELISA e apenas 0,4% pela IFI. Barbosa cols3 mostraram uma prevalência na IFI de 3,2% e no ELISA de 10,2% em 215 cães estudados.

A busca por leishmaniose felina na região estudada justifica-se pelos relatos da infecção natural desse animal em diferentes regiões do Brasil18 26 29 30 e do mundo4 5 27, o que sugere um possível envolvimento na epidemiologia das leishmanioses.

Dos 43 gatos examinados, embora nenhum tenha apresentado lesões cutâneas, a prevalência sorológica foi semelhante aos achados de Poli cols27, onde foi encontrado uma positividade de 0,9%, em 110 felinos avaliados pela técnica de IFI, e aos resultados de Michael cols20, que utilizando o teste de hemaglutinação indireta, relataram 3,7% de positividade em felinos do Egito, sendo inferior às prevalências encontradas por Vita cols34 (16,3%) e Martin-Sanchez cols14 (28,3%).

Apesar da região estudada não ser considerada endêmica para LTA, o inquérito sorológico realizado nos cães mostrou um percentual elevado de animais positivos. O isolamento de Leishmania em meio de cultura e posterior identificação etiológica confirmam a circulação da Leishmania (Viannia) braziliensis no bairro de Santa Rita de Cássia, município de Barra Mansa, RJ sendo necessários estudos mais detalhados principalmente sobre a fauna flebotomínica local e sobre a exposição da população humana frente à infecção deste parasita.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos à população da comunidade de Santa Rita de Cássia pela colaboração, paciência e apoio à equipe de pesquisadores de campo.

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Endereço para correspondência:

Dr. Fabiano Borges Figueiredo

Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos/IPEC/FIOCRUZ

Av. Brasil 4365, 21045-900 Rio de Janeiro, RJ

Tel: [phone]

e-mail: [email protected]

Recebido para publicação em 17/12/2007

Aceito em 05/03/2009