HONGOS CAUSANTES DE PODREDUMBRES EN LA POSCOSECHA DE MORA (Rubus glaucus): AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN, Y EVALUACIÓN DEL GÉNERO MÁS AGRESIVO/FUNGI THAT CAUSE ROT IN POSTHARVEST OF BLACKBERRIES (Rubus glaucus): ISOLATION, IDENTIFICATION, AND EVALUATION OF THE MOST AGGRESSIVE GENUS

Headnote

RESUMEN

Antecedentes: La mora de Castilla constituye un recurso alimentario de excelente calidad. Las pérdidas durante la poscosecha de los frutos pueden llegar al 21% de la producción total y este hecho se debe principalmente a podredumbres fúngicas. La identificación de los hongos patógenos responsables de estas pérdidas podría ayudar a controlar su desarrollo y proliferación. Objetivo: Aislar e identificar los diferentes hongos causantes de podredumbres durante el período poscosecha de mora de Castilla y determinar el género de hongo más agresivo. Métodos: Para el aislamiento de los hongos patógenos se utilizó mora de Castilla proveniente de la provincia de Tungurahua-Ecuador. Se purificaron las cepas obtenidas en placas Petri con medio PDA y se caracterizaron e identificaron a nivel de género. Se inocularon artificialmente suspensiones de esporas de los hongos seleccionados, preparadas a concentraciones de 103 y 105 conidiasmL-1 en moras de Castilla, ya sea mediante una herida en el centro de los frutos, o mediante la inmersión de los frutos en las suspensiones. Se utilizaron en total 432 frutos. Se determinó el hongo más agresivo por medio del cálculo del índice de incidencia de enfermedad (IIE). Los frutos se almacenaron a 4°C y 90% de humedad relativa hasta 14 días. Los resultados fueron analizados mediante un análisis de varianza ANOVA con un nivel de significación del 95% y con el procedimiento de las menores diferencias significativas de Fisher (LSD). Resultados: Se obtuvieron 8 géneros de hongos diferentes: Penicillium spp, Botrytis spp, Colletotrichum spp, Mucor spp, Rhizopus spp, Fusarium spp, Geotrichum spp y Cladosporium spp. El IIE más alto se obtuvo con Botrytis spp. Conclusiones: Los dos métodos de inoculación aplicados en los frutos fueron efectivos y causaron distintos grados de pudrición en las moras (sin presentar diferencias estadísticamente significativas). El género de hongo causante de la podredumbre más severa durante el período poscosecha de la mora de Castilla fue Botrytis spp.

Palabras clave: Mora de Castilla, hongos, podredumbre, poscosecha.

ABSTRACT

Background: The blackberry is a food resource of excellent quality. Postharvest losses of blackberries can reach 21% of total production, and is mainly due to fungal rots. The identification of pathogenic fungi responsible for these losses could help to control its development and proliferation. Objective: To isolate and identify different fungi that cause decay during the postharvest period of blackberry, and to establish the most aggressive fungi genus. Methods: Blackberry from the province of Tungurahua in Ecuador was used for the isolation of pathogenic fungi. The fungal strains were purified in Petri plates with PDA medium. The pathogenic fungi were characterized and identified to genus level. Various types of fungi were selected to artificially inoculate in blackberries with two different concentrations, 103 and 105 conidiasmL-1 by two methods, wounding the center of the fruit and immersing the fruits in spore suspensions. In our study were used 432 fruits. The most aggressive fungal genus was determined by calculating the incidence of disease index (IDI) of each mold. The fruits were stored at 4°C and 90% relative humidity up to 14 days. The results were analyzed by ANOVA with a significance level of 95% and with the procedure of Fisher's least significant difference (LSD). Results: 8 different fungus strains were obtained: Penicillium spp, Botrytis spp, Colletotrichum spp, Mucor spp, Rhizopus spp, Fusarium spp, Geotrichum spp and Cladosporium spp. The highest IDI was obtained with Botrytis spp mold. Conclusions: The two inoculation methods applied in the fruits were effective and caused different rot degrees in the berries (with no statistically significant difference). Botrytis spp was the fungal genus that caused the most severe decay during post harvest period.

Keywords: Blackberry, fungi, rot, postharvest.

(ProQuest: ... denotes formula omitted.)

INTRODUCCIÓN

La mora de Castilla (Rubus glaucus) tiene su origen en la Cordillera de los Andes ecuatorianos y colombianos (1). Se caracteriza por su bajo valor calórico, y por la gran cantidad de pigmentos naturales y antioxidantes polifenólicos que posee (2). En el Ecuador la producción anual está entre 12 y 14 t, y las pérdidas por pudriciones pueden llegar al 21% de la producción total (3). Los microorganismos patógenos responsables de las pudriciones en mora de Castilla son los hongos (4). Los principales hongos que se desarrollan en estos frutos son Botrytis spp, Rhisopus spp y Colletotrichum spp (5). El objetivo de esta investigación fue aislar e identificar los diferentes géneros de hongos causantes de podredumbres durante el periodo poscosecha de la mora de castilla (Rubus glaucus) y determinar el género de hongo más patogénico.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento e identificación de los hongos patógenos a nivel de género

Se utilizaron moras de Castilla (Rubus glaucus) provenientes de la provincia de Tungurahua - Ecuador. Los frutos con presencia de pudrición se colocaron en erlenmeyers con agua+tween80 estéril, y de cada erlenmeyer se realizó un banco triple de diluciones D2, D3 y D4. Posteriormente, se sembraron 0,1 mL de cada dilución en placas Petri con medio PDA, se incubaron (25°C), y después de 48 horas se realizaron las primeras observaciones. Se utilizaron en total 180 frutos. Las cepas aisladas se purificaron mediante sucesivas resiembras en placas Petri con medio PDA hasta obtener la cepa del hongo patógeno libre de contaminaciones. Para la identificación, se observaron las características macroscópicas y microscópicas y se identificó las diferentes cepas (6). Se seleccionaron los 3 principales géneros de hongos que atacan al cultivo de mora de Castilla para probar su severidad.

Evaluación del género de hongo más agresivo mediante el cálculo del IIE

Se aplicaron dos métodos de inoculación; el primer método de inoculación se realizó mediante una herida en el centro de cada fruto, donde se inocularon 15 uL de la suspensión de esporas de cada uno de los microorganismos seleccionados. El segundo método se realizó mediante la inmersión de los frutos en la suspensión de esporas de cada hongo. Se tomaron grupos de 6 frutos, se colocaron en papel filtro y se sumergieron en suspensiones de esporas de los hongos durante 30 s. Posteriormente se eliminó el exceso de agua de los frutos. Se determinó la severidad de los 3 hongos seleccionados, inoculados a dos concentraciones diferentes: 103 y 105 conidiasmL-1 (7) y mediante los dos métodos de inoculación. En cada método se utilizó un diseño factorial 3 x 2, donde las variables fueron tipo de hongo y concentración del inóculo. Se utilizaron un total de 432 frutos. Los frutos inoculados se almacenaron en refrigeración a 4°C y 90% de humedad relativa. Se realizaron observaciones entre los días 1 y 14 posteriores a la inoculación y de cada fruto se calculó el IIE mediante la Ecuación 1.

...

Donde:

a,b,c,d = número de frutos asignados a la categoría de escala de valores 0, 1, 2, 3 según el grado de pudrición que presenta la fruta

n = número total de frutos inoculados

Análisis estadístico

Los datos fueron analizados mediante un análisis de varianza ANOVA con un nivel de significación del 95 % y con el procedimiento de las menores diferencias significativas de Fisher (LSD). Los cálculos se realizaron en el programa Statgraphics Centurion XV.

RESULTADOS

Identificación de los hongos patógenos a nivel de género

Se obtuvieron un total de 8 géneros de hongos diferentes. Las figuras 1 y 2 presentan el aspecto macroscópico y microscópico de las placas Petri con los hongos.

Las figura 3 representa los resultados del IIE de Botrytis spp, Rhizopus spp y Colletotrichum spp inoculados artificialmente en los frutos mediante los dos métodos.

DISCUSIÓN

Identificación de los diferentes géneros de hongos

Penicillium spp: Las colonias eran planas, de aspecto aterciopelado y tonalidades verdes (Figura 1A). La cepa HM5 formó conidios en estructuras ramificadas con la característica forma de pincel. Las esporas eran lisas y tenían forma cilíndrica o esférica (Figura 1a). Estas características coinciden con las descritas por Pitt et al., 2009 y Samson et al., 2000 (8, 9).

Rhizopus spp: El micelio fue abundante flocoso y blando. Los esporangios de la cepa HM8 eran visibles de color blanco en los primeros días, y posteriormente negros. (Figura 1B). Las esporangiosporas eran lisas, de forma esférica y color negro (Figura 1b). Esta descripción coincide con lo indicado por la Trigos et al., 2014 y la UCDAVIS, 2014 (10, 11).

Botrytis spp: Las colonias la cepa HM11 eran irregulares, algodonosas y de color marrón (Figura 1C). Los conidióforos presentaron ramificaciones alternas. Las conidias eran lisas, de forma esférica o elipsoidal (Figura 1c). Esta descripción coincide con los autores Dominguez et al., 2009 y Aszú, 2015 (12, 13).

Colletotrichum spp: Las colonias la cepa HM14 eran algodonosas y de tonalidades verdes (Figura 1D). Las conidias eran planas y fusiformes (Figura 1d). Esta descripción coincide con lo indicado por los autores Aszú, 2015 y Elad et al., 2005 (13, 14).

Fusarium spp: El micelio aéreo de la cepa HM16 era abundante, algodonoso y de color ligeramente rosa (Figura 2E). Se observaron dos tipos de conidias, las macroconidias eran hialinas, fusiformes y presentaban múltiples septos. Las microconidias se encontraban en cadena o en racimos y tenían forma cilíndrica (Figura 2e). Los autores Prats, 2007y Tapia et al., 2014 (15, 16) coinciden con estas características.

Geotrichum spp: La cepa HM1' presentó micelio aéreo escaso y colonias planas y de color blanco (Figura 2F). Los conidióforos se fragmentaban lateralmente para formar artroconidias en forma cilíndrica que salían perpendicularmente de la hifa principal (Figura 2f). La descripción coincide con Pitt et al., 2009 (8).

Cladosporium spp: Las colonias de la cepa HM9' eran de color verde oliva y de aspecto aterciopelado (Figura 2G). Las conidias eran fusiformes o de forma esférica y aparecían solitarias o formando cadenas (Figura 2g). La descripción coincide con Pitt et al., 2009 y Samson, 2000 (8, 9).

Mucor spp: El micelio de la cepa HM13' era abundante, de aspecto algodonoso y de color blanco (Figura 2H). Las esporas eran lisas y tenían forma elipsoidal o esférica (Figura 2h). Estas características coinciden con lo que indicaron Trigos et al., 2008 y Prats, 2007 (10, 15).

Evaluación del género de hongo más agresivo mediante el cálculo del IIE

Los frutos inoculados con 105 conidiasmL-1 de Botrytis spp mediante el segundo método presentaron el mayor IIE con un valor de 80,09% (Figura 3J). No se presentaron diferencias estadísticamente significativas entre los métodos de inoculación y las concentraciones probadas (Figuras 3I y 3J). Sin embargo hubo diferencias estadísticamente significativas entre los frutos inoculados con Botrytis spp, Colletotrichum spp y Rhizopus spp. La temperatura óptima para el desarrollo de Botrytis spp es de 17 - 21°C, pero puede vivir en temperaturas de refrigeración (4°C) (6, 14) por lo que es responsable de graves pérdidas durante la poscosecha y comercialización de los frutos.

Limitaciones

La principal limitación de esta investigación se encontró en la inoculación de los frutos mediante las diferentes técnicas ya que las moras son pequeñas, frágiles y de color oscuro.

CONCLUSIONES

Se identificaron ocho géneros de hongos patógenos. Las podredumbres provocadas por Botrytis spp fueron más severas que las podredumbres provocadas por Colletotrichum spp y Rhizopus spp.

AGRADECIMIENTOS

Esta investigación fue financiada por la Escuela Politécnica Nacional, a través del Proyecto PIMI 14- 16, y contó con el auspicio del Programa Prometeo de la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología (SENESCYT) de Ecuador.

References

REFERENCIAS

1. Martínez A, Beltrán O, Velastegui G, Yánez W, Valle E. Manual del Cultivo de la Mora de Castilla. Primera ed. Ambato, Ecuador: CFC. 2007; 20 p.

2. Huang W, Zhang H, Liu W, Chun Y. Survey of antioxidant capacity and phenolic composition of blueberry, blackberry and strawberry. Journal of Zhejiang.2012; 13(2): 94-102.

3 .Tamara L, Vallejo I. Perfil de mora. Primera ed. Ibarra, Ecuador; CIIC. 2009; 24 p.

4. Betts R. Microbial update Yeast and Moulds. International Food Hygiene. 2013; 24(4): 9-11.

5. Ramírez J, Aristizábal I, Restrepo J. Blackberry conservation through the application of edible coating of aloe vera micilaginous gel. Vitae. 2013; 20(3): 172-183.

6. Farrera R, Zambrano A, Ortiz F. Identificación de hongos asociados a enfermedades del fruto de la fresa en el municipio Jauregui. Fac. Agron. LUZ. 2007; 24(1): 269-281.

7. Cañedo V, Ames T. Manual de laboratorio para el manejo de hongos entomopatógenos. Primera ed. Lima, Perú: CIP. 2004; 68 p.

8. Pitt J, Hocking A. Fungi and Food Spoilage. Third ed; Australia: Hardcover. 2009; 524p.

9. Samson R, Pitt J. Integration of Modern Taxonomic Methods for Penicillium and Aspergillus Classification. First ed. Amsterdam: Hardwood Academic Publishers. 2000; 513p.

10. Trigos Á, Ramírez K, Salinas A. Presencia de hongos fitopatógenos en frutas y hortalizas y su relación en la seguridad alimentaria. Revista Mexicana de Micología. 2008; 28(1): 125-129.

11. UCDAVIS. Viticulture and Enology [Internet] California US: UCDAVIS. 2014. [Citado en Diciembre 2015]. Disponible en: http://wineserver.ucdavis.edu/industry/enology/winemicro/ wineyeast/penicillium.html

12. Dominguez I, Carrero C, Pino H, Quintero K. Prediction of damage intensity mechanism of gray mould. Agricultura Andina. 2009; 15(1): 78-84.

13. Aszú T. Gray mold rot [Internet]. UK: Encyclopedia Britannica. 2015. [Citado en Enero 2016]. Disponible en: http://www. britannica.com/science/Botrytis

14. Elad Y, Williamsoon B, Tudzynsky P, Delen N. Botrytis spp and diseases they cause in Agricultural Systems. Biology, Pathology and Control. 2005; 1(8): 1-8.

15. Prats G. Microbiología Clínica. Primera ed. Buenos Aires, Argentina: Panamericana; 2007. 366 p.

16. Tapia C, Amaro J. Género Fusarium. Infectol. 2014; 31(1): 85-86.