EVALUACIÓN DE PROTOCOLOS PARA EL ESTABLECIMIENTO Y DESINFECCIÓN in vitro DE MERISTEMOS DE PLATANO Musa spp/ASSESSMENT PROTOCOLS FOR THE ESTABLISHMENT AND DISINFECTION in vitro MERISTEM OF BANANA Musa spp

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RESUMEN

Antecedentes: El plátano es el cuarto cultivo más importante del mundo, considerado un producto básico de exportación en numerosos países; presentando problemas de manejo de plantaciones y alta incidencia de plagas y enfermedades, qu afectan negativamente la producción, el uso de herramientas biotecnológicas como el cultivo in vitro de tejidos vegetales permite obtener miles de plántulas de similar tamaño, edad, calidad y de elevado valor genético, siendo la contaminación del medio de cultivo un problema considerable y causado por microorganismos presentes en las células vegetales, que no se puede eliminar mediante la desinfección externa. Objetivos: Este trabajo evaluó el efecto de dos concentraciones de NaClO a diferentes tiempos y la concentración de hormonas en la generación de brotes de meristemos de plátano dominico hartón Musa spp. Métodos: La fase experimental, se realizó mediante el establecimiento aséptico del cultivo y la preparación del medio; se utilizó un modelo de regresión logística para estudiar el efecto de dos tratamientos de desinfección en la contaminación de los explantes (meristemos), para el establecimiento y la mayor contaminación por hongos y bacterias, tanto en el medio como en el explante. Resultados: El Tratamiento T1, presento un efecto significativo en la contaminación de los explantes (p<0,05) evidenciando, una probabilidad de contaminación 8,65 veces mayor que T2, de igual manera al evaluar dos medios de cultivo para el establecimiento M1, M2, de los meristemos, el medio de cultivo para el establecimiento M2, tuvo un efecto significativo en el brote (p<0,05) presentando una probabilidad de brote 4,36 veces mayor en el medio de establecimiento M1. Conclusiones: La contaminación por hongos en los medios de cultivo evaluados, no es significativa tanto en el medio como en el explantes. Por otra parte, el medio de cultivo demostró ser significativo (p<0,05) en la contaminación por bacterias, tanto en el medio como en los explantes. La adición de un antibiótico resulta ser efectivo para reducir los niveles de contaminación por bacterias presentes en los explantes de meristemos de plátano Musassp establecidos in vitro.

Palabras clave: Antibióticos, hormonas in vitro, medios de cultivo meristemos.

ABSTRACT

Background: The banana is the fourth most important crop in the world, considered an export commodity in many countries; presenting problems of plantation management and high incidence of pests and diseases, which negatively affect the production, use of biotechnological tools as the in vitro culture of plant tissues allows thousands of seedlings of similar size, age, quality and high genetic value, being pollution of the culture medium a considerable problem and caused by microorganisms present in the plant cells that cannot be deleted through the external disinfection. Objectives: This study evaluated the effect of two concentrations of NaClO at different times and the concentration of hormones in the generation of outbreaks of banana meristems Dominico Harton Musa spp. Methods: The experimental phase, was carried out by means of the establishment of the cultivation and aseptic preparation of the environment; a logistic regression model was used to study the effect of two disinfection treatments on the pollution of the explants (meristem), for the establishment and the greatest contamination by fungi and bacteria, both in the east and in the explant. Results: The treatment T1, produced a significant effect on the pollution of the explants (p<0.05) introducing, a of contamination 8.65 times greater than T2, similarly to evaluate two culture media for the establishment M1, M2, the meristems, the culture medium for the establishment M2, had a significant effect on the outbreak (p<0.05) presenting a probability of outbreak 4.36 times greater in the middle of establishment M1. Conclusions: The contamination by fungi in the culture media evaluated, is not significant in both the east and in the explants. On the other hand, the culture medium proved to be significant (p<0.05) in the contamination by bacteria, both in the east as in the explants. The dd antibiotic is to be effective in reducing the levels of contamination by bacteria present in the explants of meristems of plantain Musa ssp established in vitro.

Keywords: Antibiotics, hormones in vitro, meristem culture media

INTRODUCCIÓN

El plátano es el cuarto cultivo más importante del mundo, es considerado un producto básico y de exportación, fuente de empleo e ingresos en numerosos países en desarrollo. El producto que entra en el comercio internacional es el procedente de los países latinoamericanos y del Caribe, entre los cuales se encuentra Colombia. (1). Uno de los problemas más frecuentes para estos cultivos es el inadecuado manejo de las plantaciones y la alta incidencia de plagas y enfermedades, que afectan negativamente la producción. Es por ello que el uso de herramientas biotecnológicas como el cultivo in vitro de tejidos vegetales permite obtener varios miles de plántulas de similar tamaño, edad, calidad y de elevado valor genético (2). Aunque la propagación de plantas a través de la técnica de cultivo de tejidos se encuentra limitada por la presencia de microorganismos contaminantes, y existen pocas publicaciones sobre técnicas de esterilización y de manejo de la contaminación ocasionada por hongos y bacterias. La contaminación del medio de cultivo es un problema considerable y es causada por microorganismos presentes dentro de las células vegetales, que no se puede eliminar mediante la desinfección externa. Una de las formas de combatir este problema es adicionando al medio antibióticos (3), sin embargo, existen objeciones al uso generalizado de éstos para el control de contaminantes pues algunos no destruyen a todos los microorganismos, sólo los suprimen o generan retardos en su metabolismo, por lo que descuidos en las técnicas asépticas pueden generar resistencia, siendo más difícil controlarlos. Algunas de las sustancias más utilizadas en técnicas de desinfección del material vegetal son el hipoclorito de sodio (NaClO), hipoclorito de calcio (CaClO), peróxido de hidrógeno (H2O2), etanol (C2H5OH) y bicloruro de mercurio (HgCl2), donde el hipoclorito de sodio ha sido el compuesto más frecuentemente empleado, con resultados apropiados para la desinfección y el establecimiento in vitro del material vegetal, a concentraciones y tiempos diferentes. El hipoclorito de sodio (NaClO), es efectivo, económico y de fácil adquisición (4). El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de dos concentraciones de NaClO a diferentes tiempos y el efecto de la concentración de hormonas en la generación de brotes de meristemos de plátano dominico hartón Musa spp.

MÉTODOS

La fase experimental, se realizó con una adaptación del método descrito por Marín et al. (5), que incluye las fases de establecimiento aséptico del cultivo y preparación del medio de cultivo. El material vegetal (colinos), se colectó en los municipios de Armenia, Calarcá, Filandia y Montenegro donde se encontraron cultivos en estado adulto. Para la selección de los (colinos) se tuvo en cuenta las condiciones fitosanitarias como la sanidad de la planta, Producción del cultivo, como se indica en la Figura 1.

Establecimiento aséptico del cultivo

Se colectaron colinos (100) que fueron reducidos a un tamaño de 15 cm para la obtención del meristemo, se empacaron en papel periódico húmedo y se depositaron en nevera de icopor con gel de enfriamiento para ser transportados al laboratorio, evaluándose dos tratamientos de desinfección (ver tabla 1).

Posteriormente todos los colinos se lavaron con jabón neutro, se realizó una reducción de tamaño entre 3 y 4 cm, una vez extraídos los meristemos, la mitad (50) se sumergieron en el tratamiento de desinfección 1 (T1), y la otra mitad en tratamiento de desinfección 2 (T2) y por último se adiciono agua destilada para eliminar residuos de desinfectante.

Preparación del Medio de Cultivo: Para la preparación del medio de cultivo se utilizaron las concentraciones y cantidades sugeridas por otros autores (5) y ajustado a un pH 5,7. (Tabla 2).

Las variables que se evaluaron fueron, el porcentaje de explantes contaminados y el porcentaje de explantes con brotes; para el análisis estadístico se empleó un modelo de regresión logística, el cual consistió de un análisis de regresión para predecir la efectividad de los tratamientos de desinfección y el efecto de los medios de cultivo en el brote de los explantes, en función de los explantes contaminados y los explantes con brotes, trabajando con 5% de probabilidad de error y empleándose el paquete estadístico stapgrafic para el análisis de los resultados.

RESULTADOS

Se observó que el tratamiento (T1), produjo un efecto significativo en la contaminación de los explantes (p<0,05) presentando una probabilidad de contaminación 8,65 veces mayor que T2 (Figura 2), lo que indica que este último es más adecuado para la desinfección de los explantes y su posterior establecimiento.

Para el medio de cultivo se observó un efecto significativo en el brote (p<0,05) presentando una probabilidad de brote 4,36 veces mayor en (M1) que en (M2) (Figura 3).

DISCUSIÓN

La asociación explante-medio y las condiciones físicas en que normalmente se incuban los cultivos conforman un ambiente propicio para la proliferación de microorganismos (bacterias, hongos), los cuales pueden destruir tales cultivos y competir con el explante por el medio de cultivo o modificarlo (5). Por otra parte, los medios de cultivo demostraron ser significativos (p<0,05) en la contaminación por bacterias, tanto en el medio como en el explante, siendo notablemente mayor la contaminación en (M2) (Figura 3). La contaminación del medio presentó problemas considerables y fue causada por microorganismos presentes dentro de las células vegetales y que no se pudieron eliminar mediante la desinfección externa; la manera con que se combatió este problema fue mediante la adición de antibióticos al medio de cultivo.

En la fase de establecimiento los meristemos presentaron un engrosamiento prudente (figura 4) aunque todos los explantes tratados, presentaron oxidación desde su iniciación, esto no es un obstáculo para el establecimiento y multiplicación del plátano, en este estudio los meristemos de plátano se mantienen en la fase de establecimiento.

El tratamiento (T2), resultó ser el más efectivo para la desinfección de los explantes, este tratamiento contenía 2 mg/L de antibiótico estreptomicina, como lo propuesto en otras investigaciones (6), en algunos casos el uso de antibióticos es capaz de incrementar la tasa de crecimiento de los tejidos cultivados in vitro. Algunos autores (7) reportan que la utilización de antibióticos en grandes cantidades generalmente conduce a una fitotoxicidad, por que inhiben el crecimiento y desarrollo de plantas superiores. La contaminación por hongos en los medios de cultivo evaluados no mostró ser significativa tanto en el medio como en el explante. La propagación de plantas a través de la técnica de cultivo de tejidos se encuentra limitada por la presencia de microorganismos contaminantes ocasionada por hongos y bacterias, similar a lo propuesto por otros autores (8), en donde reportan que la contaminación bacteriana es un problema para el desarrollo de algunas especies in vitro, y ésta es la causa de una gran cantidad de fracasos. Tanto en los tratamientos evaluados de desinfección como en los de establecimiento resulto ser más efectivo el tratamiento que contenía antibiótico, aunque algunos autores (8), afirman que el empleo de antibióticos solamente se justifica, en casos de excepción y en cultivos de corta duración.

CONCLUSIONES

El uso de antibióticos en la etapa de desinfección y el establecimiento de meristemos de plátano puede ser una alternativa en la eliminación de microorganismos que los explantes contraen tanto endógenos como exógenos. El Hipoclorito de sodio sigue siendo uno de los mejores desinfectantes usados en la técnicas de cultivo in vitro, evitando contaminaciones bajas por hongos y bacterias en los explantes. Para el establecimiento in vitro de plátano es necesario utilizar la Hormona BAP en combinaciones con auxina.

References

REFERENCIAS

1. Martínez G O, Tremont Y J, Hernández. Manual técnico pata la propagación de Musáceas. 2004. Revista Digital Ceniap Hoy 4. Enero - Abril. Maracay, Venezuela. URL:www.ceniap.gov. ve/ceniaphoy/articulos/n4/texto/gmartinez.htm (visitado el 28/12/2008).

2. Usui K, Okabe K, Pernillo R, Ramírez A. Principios Básicos del Cultivo de Tejidos Vegetales. Guatemala ICTA/JOV. 1996. 1, 87 p.

3. Rodríguez J. L. et al. Obtención y propagación de plantas de alcatraz Zantedeschia sp. . A partir del cultivo in vitro de yemas de bulbo. Memorias del III Congreso Nacional de Biotecnología. ANABAF. Chihuahua. México.1996. 50 p.

4. Medero V, Del sol L, García M, López J, Ventura C, Rodríguez S. Metodología para la micropropagación del ñame (Dioscorea alata L.). Resúmenes BIOCAT-99, Granma, Cuba. 1999; 12 p.

5. Marín A, Albarrán J G, Fuenmayor F, Dinaba Perdomo. Evaluación del efecto de los reguladores de crecimiento en la regeneración in vitro de cinco cultivares élites de yuca (Manihot esculenta Crantz). Revista Científica UDO Agrícola, ISSN-e 1317- 9152. 2009; 9(3): 556-562.

6. Martínez Y M, Villegas M A, Villegas A, Tejacal I, Villegas O G, López V. Cultivo in vitro de pitayo (Stenocereus stellatus [Pfeiffer] Riccobono). Revista Chapingo. Ser.Hortic. Chapingo sep./dic. 2011; 17(3)

7. Pereira G A, Ribeiro B V, Marcílio H C, Santaella M B. Desinfestação e estabelecimento in vitro de explantes de bananeira IAC 2001 em diferentes concentrações de hipoclorito de sódio. Tecnologia e Ciência Agropecuária. 2009. 3, 43.

8. Hernández J, González M E. Efectos de la contaminación microbiana y oxidación fenólica en el establecimiento in vitro de frutales perennes. Cultivos Tropicales. La Habana. 2010; 31(4)