DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS (CATEQUINAS, CAFEÍNA, ÁCIDOS ORGÁNICOS) EN TE VERDE (Camellia sinensis) USANDO CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN/DETERMINATION OF PHENOLIC COMPOUNDS (CATECHINS, CAFFEINE, ORGANIC ACID) OF GREEN TEA (camellia sinensis) USING HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY RESOLUTION

Headnote

RESUMEN

Antecedentes: La búsqueda de compuestos antioxidantes es un área que cada día adquiere más relevancia por el aumento de enfermedades y factores ambientales que contribuyen a la generación de radicales libres, se hace necesaria la búsqueda de fuentes de compuestos que generen equilibrio para contrarrestar estos radicales, una de estas fuentes naturales es el Té verde, que ha comenzado a hacer parte de la dieta de los colombianos para mejorar la salud de forma natural. Objetivos: Determinar las condiciones para la extracción de catequinas, cafeína y algunos ácidos fenólicos presentes en el té e implementar un método cromatográfico que permita separar, identificar y cuantificar dichos compuestos; comparar la calidad química de diferentes marcas de Té comercializadas en Colombia. MÉTODOS: Se usó diferentes marcas de té: Oriental, Hindú, Liptón y Jaibel, los extractos se obtuvieron mediante reflujo con agua acidulada. El método cromatográfico se desarrolló en fase reversa empleando una columna Ultra AQ C-18, y elución en gradiente (Ácido acético, acetato de etilo y Acetonitrilo). Resultados: Se cuantificaron 10 compuestos presentes en el extracto de Té, los mayoritarios fueron Epigalocatequingalato (EGCG), cafeína y acido Gálico. Conclusión: El método cromatográfico permitió cuantificar 10 compuestos presentes en el extracto acuoso del Té. La actividad antioxidante previamente establecida en estas muestras permitió concluir que el contenido de compuestos fenólicos y flavonoides especialmente la EGCG se relaciona con dicha actividad.

Palabras clave: Antioxidantes, Camellia sinensis, cromatografía líquida, fase reversa flavonoides, nutraceuticos, Té verde,

ABSTRACT

Background: The determination of antioxidant compounds is a research field that everyday becomes more relevant because of the increase of diseases and environmental factors contributing to the generation of free radicals, therefore, the location of antioxidants sources are necessary to create a balance that off sets the radical damage. Green tea is considere done of these natural sources which has begun to be part of the diet of Colombians seeking to improve their health naturally. Objectives: Determine the optimal conditions for the simultaneous extraction of catechins, caffeine and some phenolic acids present in green tea and implement a chromatographic method to separate, identify and quantify these compounds responsable for antioxidant activity; Also compare the chemical quality of different brands of tea sold in Colombia. Methods: Different brands of green tea obtained directly from the chain stores are used, these are: Oriental, Hindú, Lipton and Jaibel, the extracts were obtained by refluxing with acidulated water. The chromatographic method was developed using a reversed phase column C AQ-18 Ultra and gradient elution composed of acetic acid, ethylacetate and acetonitrile. Samples and standards were analyzed in triplicate. Results: Ten compounds in Green tea extracts were separated, identified and quantified, epigallocatechingallate (EGCG), caffeine and gallic acid were the major compounds. Conclusions: The chromatographic method allowed to quantify 10 compounds present in the aqueous extract of green tea. The antioxidant activity previously established on the sesamples showed that this content of flavonoids and phenolic compounds EGCG especially relates tosuch activity.

Keywords: Antioxidants, camellia sinensis, liquid chromatography, flavonoids, reverse phase, nutraceuticals, green tea.

INTRODUCCIÓN

Se considera que los alimentos nutracéuticos tienen efectos terapéuticos y su consumo ha ido aumentando por la población en general. El té en su forma pura se considera una de las bebidas naturales más benéficas para la salud. Los fitoquímicos son compuestos bioactivos que se generan en las plantas e incluyen metabolitos secundarios que surgen como mecanismo de defensa y adaptación al estrés del medio ambiente. En el Té se han reportado alrededor de 4000 compuestos bioactivos, de los cuales la tercera parte son compuestos fenólicos principalmente flavonoides, conocidos como catequinas, estos compuestos son responsables de la actividad antioxidante mediante la neutralización de radicales libres generados en los procesos metabólicos(1). La mayoría de las catequinas que se encuentran en los extractos de té verde son conocidas como (+)-catequina (C), (-)-epicatequina (EC), (+)-galocatequina (GC), (-)-epicatequingalato (ECG), (-) epigalocatequina (EGC), y (-)- epigalocatequingalato (EGCG), además de la cafeína quien tiene un efecto estimulante, (2)1.8\u03bcm. Sus contenidos pueden variar según las características del Té. Para obtener el té verde las hojas son tratadas con vapor a altas temperaturas y secadas para desactivar la polifenoloxidasa y prevenir la oxidación catequinas y la degradación enzimática de vitaminas. (3). También puede variar con el tiempo, edad de las hojas, clima, y post cosecha.(4), por ejemplo la variedad assamica generalmente no es usada para la producción de té verde porque el contenido de flavonoides lo hace ser una bebida más amarga que los de variedad sinensis (5). La calidad del té se relaciona con la composición de sus constituyentes, por lo tanto es importante desarrollar un método analítico que permita evaluar la naturaleza y la capacidad biológica de catequinas en muestras como cosméticos bebidas, suplementos dietarios, u otros alimentos a base de té (2)1.8\u03bcm. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un método para, separar, identificar y cuantificar Cafeina (CAF), acido gálico (AG), Acido Clorogenico (AC), Acido ferrulico (AF)trigonelina (T), Catequina (C), Galocatequina (GC), Epicatequingalato (ECG) Epigalocatequina (EGC), Epicatequina (EC), Epigalocatequingalato (EGCG) en cuatro muestras de té verde comercializadas es Colombia.

MATERIALES Y MÉTODOS

Las muestras se seleccionaron de los almacenes de cadena, las marcas fueron: Oriental, Hindú, Liptón y Jaibel, cada muestra de té fue analizada por triplicado.

Extracción y análisis cromatografico

Se tomó 0,2 gramos de cada muestra de Té, con 10 mL de ácido acético 0,1% y se sometió a un proceso de reflujo durante 30 minutos, se dejó enfriar y se centrifugo a 7500 rpm por 15 minutos. El sobrenadante se llevó a 15 mL, se alicuotó y se guardó a 4 °C. Los extractos fueron analizados en un cromatógrafo líquido, Jasco 2000 con detector de arreglo de Diodos Jasco MD- 2015 Plus, Automuestreador Jasco AS-2059 Plus y horno Jasco CO-2065 Plus. Las separación se realizó en una columna en fase reversa (Ultra AQ C-18 150 x 3,2 mm id, 3 μm de partícula), la temperatura fue de a 35°C, el software EZChromElit, la fase móvil fue ácido acético 0,5%, solvente A, y una mezcla de Acetonitrilo: Acetato de Etilo: ácido acético 0,1% en proporción (10:2:88) como solvente B. El gradiente de elución es presentado en la tabla 1. Las señales cromatográficas fueron identificadas por comparación de los tiempos de retención de las muestras con los estándares.

CURVAS DE CALIBRACIÓN

La cuantificación se realizó por el método de estándar externo. Se prepararon soluciones Stock de T, AG, AC, CAF y EC a 5000 mg/L, EGC, C, AF y ECG a 1000 mg/L y EGCG a 2000 mg/L. preparadas en Metanol: ácido acético 0,1% (50:50 v/v).

Se prepararon las curvas de calibración con las concentraciones de trabajo: Trigonelina (1,25-20 mg/L), Catequina (1-10mg/L), Epigalocatequingalato (50-300 mg/L), Acido gálico (5-80 mg/L), Cafeína (25-400 mg/L), Acido ferrúlico (0,5 -5 mg/L), ácido Clorogénico (50-1200 mg/L), epicatequina (30-250 mg/L), Epicatequingalato (5-80 mg/L). EGC (50-600 mg/L). Cada curva de calibración se corrió por triplicado.

RESULTADOS

Se analizaron los estándares individualmente y se compararon los tiempos de retención con la mezcla de estándares, los resultados se observan en la tabla 2, en la figura 1a se muestra el perfil cromatográfico de una mezcla de estándares, se logró la separación de 9 compuestos. Con estas condiciones cromatográficas se analizaron las muestras de los extractos de té. En la figura 1b se observa el perfil cromatográfico de una muestra de té (Liptón), que al ser comparada con el perfil de una mezcla de estándares (figura 1a) permitió separar e identificar 9 compuestos fenólicos, siendo la cafeína y la EGCG los más abundantes, los compuestos se relacionan en la tabla 2.

Las concentraciones, se determinaron con las curvas de calibración de cada estándar y se resumen en la tabla 3 con su respectiva ecuación. Todas las curvas de calibración presentaron un rango lineal (0,951-0,997). Los valores de límite de detección (LD) y límite de cuantificación (LC) se calcularon determinando la relación señal-ruido de los estándares más diluidos. Se presentaron errores relativamente bajos en la gran mayoría <5, exceptuando la Catequina.

DISCUSIÓN

La extracción de la cafeína, trigonelina, ácidos e isómeros de la Catequina presentes en el té verde se realizó por reflujo, algunos autores (6)(7) establecen el tiempo de extracción entre 0,5 a 3 horas a 80 °C, aunque al realizar la comparación de los métodos de extracción Myoung-GunChoung (7), establece que la galocatequina se extrae totalmente mediante reflujo mientras que el ácido gálico, Catequina y epigalocatequingalato incrementan gradualmente por encima de las tres horas de calentamiento. Otros autores sugieren que el contenido de catequinas incrementa del 30-40% cuando se extrae por un periodo de 10 minutos, las hojas viejas contienen menos cafeína pero más EGCG (8). Generalmente los niveles de cafeína en infusiones se encuentra entre 141-338 mg/L (8), de todas las marcas quien contiene una gran cantidad de cafeína es Jaibel (233 mg/L) lo que podría sugerir que sus hojas son más jóvenes que las de las demás marcas. Al comparar los resultados obtenidos en ocho variedades de té cosechados en Korea(7), se observó similitud en cuanto a los contenidos de cafeína y catequinas, la muestra de Liptón tuvo una concentración de EGCG igual (32,9 mg/g) comparada con la obtenida por dicho estudio (32,8 mg/g); donde las muestras son extractos de Té de ocho variedades exóticas japonesas, lo que indica que el método de extracción durante 30 minutos fue el apropiado para este tipo de matriz, pues una falta de control estricto en la temperatura podría provocar rompimientos en el grupo galato(7). Comparando los resultados obtenidos en el presente estudio con otro realizado por Zielinski AAF(9) cuyo objetivo fue determinar un metodo para la optimización de la extracción los compuestos fenólicos del té, se puede afirmar que las cuatro marcas comercializadas en colombia tienen alto contenido de ácido clorogénico y EGCG, estos resultados son consistentes con reportes previos (10) que indica que la EGCG es la más abundante de las catequinas del Té. Algunos autores reportan que el contenido de EGCG en infusiones de té comercial se encuentran entre 22-53 mg/g (3), estos datos se relacionan con los obtenidos por el presente estudio pues las cuatro marcas se encuentran dentro del rango, sin embargo lipton es quien presenta diferencia por su alto contenido (Tabla 4). La actividad antioxidante de los flavonoides depende en parte de el numero y la posicion de los grupos hidroxilo en la molecula y la EGCG es el compuesto con mayor numero de grupos hidroxilo, esta caracteristica estructural la hace una molecula responsable de las actividades biologicas del Té. Todas las muestras de te verde mostraron una composcion homogenea de Catequinas, cafeina y acidos organicos siendo este un método adecaudo para la separacion, identificacion y cuantificacion de sus compuestos fenolicos.

Este trabajo contribuyo a la caracterización química de las infusiones de te verde comercializadas en Colombia, los resultados sugieren que hay diferencias en cuanto a la composicion de las marcas analizadas y por lo tanto es necesario realizar otros estudios que determinen las posibles causas de ello.

CONCLUSIÓN

Se desarrolló un método para cuantificar catequinas, cafeína y ácidos orgánicos presentes en extractos de Té comercializado en Colombia, siendo apropiado para el control de calidad de la mayoría de los productos elaborados a base de té que podrían ser importantes para la industria farmacéutica o alimentaria. La identificación química de las muestras sugiere que las marcas de mayor calidad son Oriental y Liptón.

Teniendo en cuenta la actividad antioxidante de las muestras del té se concluye que hubo correlación entre los compuestos fenólicos y dicha actividad evaluada por el método ORAC. Uno de los compuestos mayoritarios en todas las muestras fue EGCG, cafeína y Catequina a quienes se les debe posiblemente la actividad antioxidante, Liptón fue una de las marcas que presentó concentraciones altas de los compuestos individuales, la acción conjunta de cada uno de ellos puede ser el responsable de los resultados positivos encontrados en la evaluación antioxidante.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la Universidad Tecnológica de Pereira por el financiamiento del proyecto 9-15-2

References

REFERENCIA

1. Anand J, Upadhyaya B, Rawat P, Rai N. Biochemical characterization and pharmacognostic evaluation of purified catechins in green tea (Camellia sinensis) cultivars of India. 3 Biotech [Internet]. Springer Berlin Heidelberg; 2014; 285-94.

2. Naldi M, Fiori J, Gotti R, Périat A, Veuthey J-L, Guillarme D, et al. UHPLC determination of catechins for the quality control of green tea. J Pharm Biomed Anal. Elsevier B.V.; 2014 Jan [cited 2015 Sep 19]; 88:307-14. 3.

3. Namal Senanayake SPJ. Green tea extract: Chemistry, antioxidant properties and food applications A review. J Funct Foods [Internet]. Elsevier Ltd; 2013 Oct [cited 2015 Jul 11];5 (4):152941

4. Jezka-Skowron M, Zogla-Grzeskowiak A. Analysis of Antioxidant Activity, Chlorogenic Acid, and Rutin Content of Camellia sinensis Infusions Using Response Surface Methodology Optimization. Food Anal Methods;7(10):2033-41.

5. Saito ST, Fröehlich PE, Gosmann G, Bergold A. M. Full Validation of a Simple Method for Determination of Catechins and Caffeine in Brazilian Green Tea (Camellia sinensis var. assamica) Using HPLC. Chromatographia;65(9-10):607-10.

6. Liang H, Liang Y, Dong J, Lu J, Xu H, Wang H. Food Chemistry Decaffeination of fresh green tea leaf ( Camellia sinensis ) by hot water treatment.Food Chem. 2007;101:1451-6.

7. Choung M-G, Lee M-S. Optimal extraction conditions for simultaneous determination of catechins and caffeine in green tea leaves. Food Sci Biotechnol 2011;20(2):327-33.

8. Reto M, Figueira ME, Filipe HM, Almeida CMM. Chemical composition of green tea (Camellia sinensis) infusions commercialized in Portugal. Plant Foods Hum Nutr 2007;62(4):139-44.

9. Zielinski AAF, Granato D, Alberti A, Nogueira A, Demiate IM, Haminiuk CWI. Modelling the extraction of phenolic compounds and in vitro antioxidant activity of mixtures of green, white and black teas (Camellia sinensis L. Kuntze). J. Food Sci. Technol. 2015;52(11);6966-6977

10. Liu M, Tian H, Wu J-H, Cang R-R, Wang R-X, Qi X-H, et al. Relationship between gene expression and the accumulation of catechin during spring and autumn in tea plants (Camellia sinensis L.). Hortic Res. 2015;1(2):15011.