Growth Inhibition of Tanshinones on SPC-A-1 Cell Line and their Structure-activity Relationship

Abstract

背景与目的 大量研究表明丹参酮类化合物具有体外抗肿瘤作用，但很少有人综合研究丹参酮类化合物对同一种肿瘤细胞的作用情况。本文旨在比较4种丹参酮类化合物对SPC-A-1细胞的增殖抑制作用，并探讨其结构与细胞毒性之间的关联性。方法 采用改良MTT法测定不同浓度的丹参酮类化合物与细胞共培养预定时间（24 h、48 h和72 h）后对SPC-A-1细胞的增殖抑制作用；倒置显微镜下观察不同药物处理对于SPC-A-1细胞的形态学影响。结果 丹参酮类化合物均能有效抑制SPC-A-1细胞增殖，其抑制作用呈明显的时间和剂量依赖性。二氢丹参酮I、丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮作用24 h的IC值分别为2.77 μg/mL、6.01 μg/mL、>10 μg/mL和>10 μg/mL；作用48 h的IC值分别为1.80 μg/mL、4.04 μg/mL、8.12 μg/mL、8.71 μg/mL；作用72 h的IC值分别为1.36 μg/mL、1.69 μg/mL、3.81 μg/mL、7.35 μg/mL。结论 4种丹参酮类化合物均对SPC-A-1细胞具有明显的增殖抑制作用，作用强度大小依次为二氢丹参酮I、丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮，提示A环为芳环时可增强细胞毒性，C环的呋喃环结构可能影响其细胞毒性，其具体作用机理尚有待探讨。

Background and objective Numerous studies have shown that Tanshinones have anti-tumor effects in vitro, but few studies were focusing on the anti-tumor activity of Tanshinones against one special cancer cell line. The aim of this study is to investigate the growth inhibition effect of four Tanshinones on SPC-A-1 cell line and the relationship between their structures and cytotoxicity. Methods The modified MTT assay was adopted to measure the inhibition effect of Tanshinones on SPC-A-1 cells at different concentrations at 24 h, 48 h and 72 h, and the changes of cell morphology were observed by inverted phase contrast microscope. Results Tanshinones could inhibit the proliferation of SPC-A-1 cells effectively, and their cytotoxicities on SPC-A-1 cells are all in concentration-dependent and time-dependent manners. The IC50 of dihydro- Tanshinone I, Tanshinone I, Tanshinone IIA and Cryptotanshinone at 24 h were 2.77 μg/mL, 6.01 μg/mL, over 10 μg/mL and over 10 μg/mL, at 48 h were 1.80 μg/mL, 4.04 μg/mL, 8.12 μg/mL, 8.71 μg/mL, at 72 h were 1.36 μg/mL, 1.69 μg/mL, 3.81 μg/mL, 7.35 μg/mL, respectively. Conclusion All of the four Tanshinones have proliferation inhibitory effects on SPC-A-1 cell line, among which the Dihydrotanshinone I is the most active one, followed by Tanshinone I, Tanshinone IIA and Cryptotanshinone subsequently. The results showed that the structure of aromatic ring A could enhance the cytotoxicity and the structure of furan ring C would influence the cytotoxicity, but the mechanism is still remained to be further investigated.

肺癌在我国已占据恶性肿瘤发病率及死亡率的 第1位，调查数据显示，我国肺癌的发病率和死亡率 一直呈上升趋势。尽管近20年来肺癌的治疗有了很大 的进展，但肺癌患者的预后却无明显提高，5年生存率仅10%-15%，而其它肿瘤的平均5年生存率能达到 62%-97%[1,2]。肺癌的流行及其严重危害已使其治疗药物 成为临床不可缺少且地位极其重要的一大类药物。因 此，寻找新的抗癌药物对肺癌的治疗具有重大意义。

丹参为唇形科鼠尾草属植物（Salvia miltiorrhiza bunge）的干燥根部，具有祛瘀止痛、活血调经、养心除 烦等功效，入药历史悠久。丹参酮（Tanshinone, Tan）作 为丹参根部的乙醚或乙醇提取物，是丹参的主要有效部 位。按其不同的化学结构可分为丹参酮I、丹参酮IIA、 丹参酮IIB、隐丹参酮、二氢丹参酮I等15种成分（图 1）。近年来大量研究[3-6]证实，丹参酮类化合物具有广 泛的抗肿瘤活性，是一种有前途的抗癌药物。本研究以 人肺腺癌细胞株SPC-A-1为研究对象，考察丹参酮类化 合物（丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮I） 对其生长抑制作用，并比较四者对SPC-A-1细胞株的药效 学差异，为探讨丹参酮类化合物细胞毒性与其结构之间 的关系以及开发用于治疗肺癌的丹参酮制剂提供实验依 据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与药品 RPMI-1640培养基为美国Gibco公司产 品；标准新生牛血清为郑州伯安生物工程有限公司产 品；四甲基偶氮唑蓝（MTT）为BIOSHARP公司产品； 二甲基亚砜（DMSO）分析纯为天津市博迪化工有限公 司产品；十二烷基硫酸钠（SDS）分析纯为广东光华化学厂有限公司产品；亚砷酸注射液（H3AsO3）为哈尔滨 伊达药业有限公司产品，实验前用RPMI-1640培养液稀释 成2 μg/mL的药液；丹参酮IIA为西安天丰生物科技有限 公司产品，由本实验室精制，纯度达99.2%（HPLC）； 丹参酮I、二氢丹参酮I、隐丹参酮均为成都曼思特生物 科技有限公司产品；丹参酮类化合物均用DMSO溶解 （DMSO终浓度为0.03%，一般认为DMSO≤0.1%时，不引 起细胞生物学形态改变），配制成1.7 mg/mL的储备液， 过滤除菌，于4 ^oC条件下避光保存备用。

1.1.2 细胞株 人肺腺癌SPC-A-1细胞株由生物治疗国家 重点实验室提供，用含10%灭活标准新生牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液，于 37 ^oC、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每2-3天传代 1次。实验用对数生长期细胞。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测细胞生长抑制率 取对数生长期的 SPC-A-1细胞，消化制成单细胞悬液后计数，调整其密度 为2×10⁴个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL；接种细 胞后，于37 ^oC、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养4 h后 给药。以等体积的亚砷酸（2 μg/mL）作为参比药物组， 不加药的细胞组作为空白对照组，RPMI-1640培养液组作 为空白组用以调零。给药组分别加入不同浓度的丹参酮 IIA、丹参酮I、二氢丹参酮I和隐丹参酮，给药浓度分别 为2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、6.0 μg/mL、8.0 μg/mL、10.0 μg/ mL，每个浓度设6个复孔，每孔20 μL。分别于培养24 h、 48 h、72 h后，加入5 mg/mL MTT液（每孔20 μL），于 37 ^oC、5%CO2孵箱中继续培养。4 h后按照文献[7]中的方 法，加入由异丁醇、浓盐酸、十二烷基硫酸钠（SDS） 配制的甲瓒裂解液（100 μL/孔），于37 ^oC、5%CO2培养 箱中孵育过夜至甲瓒全部溶解，微孔板恒温震荡仪震荡 10 min，使完全混匀。酶标仪570 nm（参比波长630 nm） 处测各孔光密度（optical density, OD）值，以该复孔的平 均值作为该组细胞的OD值，实验重复3遍，结果取其平 均值，并按公式计算细胞生长抑制率。细胞增殖抑制率 计算公式为：

抑制率=（1-实验组平均OD值/空白对照组平均OD 值）×100%。

1.2.2 倒置显微镜观察细胞形态生长情况 在加药实验过 程中，分别于24 h、48 h和72 h观察丹参酮化合物组（4.0 μg/mL）、参比药物组（2 μg/mL）以及空白对照组细胞 的生长情况。

1.2.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据以Mean±SD表示，组间比较采用One way ANOVA检验， P< 005为有统计学差异。

2 结果

2.1 丹参酮类化合物对SPC-A-1细胞的增殖抑制作用

SPC-A-1细胞经4种药物处理后，与空白对照组相比，其 OD值均有不同程度的下降，且随着药物浓度的增加及 作用时间的延长，OD值下降趋势明显（表1-表4）。其 中，二氢丹参酮I组、丹参酮I组中细胞的OD值下降较 明显，2.0 μg/mL处理24 h后，其OD值与对照组相比有统 计学差异；二氢丹参酮I组、丹参酮I组和丹参酮IIA在2.0 μg/mL处理24 h后表现出增殖抑制作用。隐丹参酮组起 效较慢，6.0 μg/mL作用24 h才表现出增殖抑制作用，且 2.0 μg/mL隐丹参酮分别作用48 h和72 h时抑制作用均不明 显，OD值与对照组相比均无统计学差异。与参比药物组 相比，4种药物对细胞的增殖抑制作用均与亚砷酸作用趋 势一致，且4.0 μg/mL二氢丹参酮I、4.0 μg/mL丹参酮I、 8.0 μg/mL丹参酮IIA、10.0 μg/mL隐丹参酮作用72 h后的抑 制率（分别为83.40%、72.57%、62.37%、69.96%）与2 μg/ mL亚砷酸作用72 h（65.22%）的抑制率相当或更高。4种 药物（二氢丹参酮I、丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮） 作用24 h后IC50值分别为2.77 μg/mL、6.01 μg/mL、> 10.00 μg/mL和> 10.00 μg/mL；作用48 h的IC50值分别为1.80 μg/ mL、4.04 μg/mL、8.12 μg/mL、8.71 μg/mL；作用72 h的 IC50值分别为1.36 μg/mL、1.69 μg/mL、3.81 μg/mL、7.35 μg/mL，可见4种药物中二氢丹参酮I起效浓度最低，其次 为丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮，且其抑制率均呈明 显的时间正相关性（表5）。

2.2 倒置相差显微镜观察细胞生长形态

SPC-A-1细胞培养 48 h后，空白对照组可见贴壁生长、细胞清晰，胞质饱满，核膜、核仁轮廓明显，相邻细胞生长融合成片（图 2A）；2 μg/mL亚砷酸组（图2B）可见视野中大部分细胞 失去贴壁特性，细胞逐渐由贴壁而脱落，细胞皱缩、体 积变小、变形，呈现出明显的增殖抑制作用与细胞凋亡 特征；二氢丹参酮I组（图2C）和丹参酮I组（图2D）中 的细胞形态与亚砷酸组相似，多数细胞由贴壁而脱落， 出现细胞变小、皱缩和变形现象，且与空白对照组相比 视野中细胞数明显减少；丹参酮IIA组（图2E）和隐丹参 酮组（图2F）中，可见部分细胞由贴壁而脱落，呈现细 胞皱缩、变小和变形的状态，与空白对照组相比视野中 细胞数明显减少，但较二氢丹参酮I组（图2C）和丹参酮 I组（图2D）视野中细胞数较多。该结果表明，四种丹 参酮类化合物均能抑制SPC-A-1细胞生长，诱导其凋亡， 其中二氢丹参酮I作用强度最强，丹参酮I和丹参酮IIA次 之，隐丹参酮的作用强度则相对较弱，与MTT检测的结 果一致。

图 1 丹参酮类化合物化学结构。A:丹参酮类化合物基本结构;B:二氢丹参酮I;C:丹参酮I;D:丹参酮IIA;E:隐丹参酮。 Fig 1 Chemical structures of Tanshinones. A: basic structure of Tanshinones; B: Dihydrotanshinone I; C: Tanshinone I; D: TanshinoneIIA; E: Cryptotanshinone.

图 2 SPC-A-1细胞培养48 h的倒置显微镜图。A:未经药物处理的细胞;B:2.0 μg/mL亚砷酸组;C:4.0 μg/mL二氢丹参酮I组;D:4.0 μg/mL丹参酮I组;E:4.0 μg/mL丹参酮ⅡA组;F:4.0 μg/mL隐丹参酮组。 Fig 2 Cell morphology observed by inverted phase contrast microscope after incubated for 48 h. A: no treatment; B: treated with 2 μg/mL arsenious acid; C: treated with 4.0 μg/mL dihydrotanshinone I; D: treated with 4.0μg/mL tanshinone I; E: treated with 4.0 μg/mL tanshinone IIA; F: treated with 4.0 μg/mL cryptotanshinone.

3 讨论

丹参酮是中药丹参的主要脂溶性成分，目前已有大 量报道其在体外能对抗多种肿瘤细胞，作用机制主要涉 及抑制肿瘤细胞增殖[8]、诱导细胞凋亡与分化、抑制细 胞侵袭及转移[9]等方面。2008年，Lee[10]观察研究了二氢 丹参酮I、丹参酮I、丹参酮IIA及隐丹参酮对HepG2细胞 的毒性作用与GSH/GSSG（还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱 甘肽）比例变化之间的关系，结果表明二氢丹参酮I及 丹参酮I诱导的细胞毒性作用与GSH/GSSG比例变化呈明 显的正相关性，而丹参酮IIA及隐丹参酮则无此相关性； Wayne[11]用此4种丹参酮化合物处理p53基因表型不同的 3株肝癌细胞系以及Pgp过表达的R-HepG2细胞，结果发 现二氢丹参酮I及丹参酮I对4种肝癌细胞均有较好的增殖抑制作用，而隐丹参酮和丹参酮IIA则对Pgp过表达的 R-HepG2更有效，其中隐丹参酮能有效抑制Pgp介导的药 物外排，丹参酮IIA与阿霉素联用则表现出最强的药物协 同作用。这些研究结果表明不同的丹参酮化合物的抗肿 瘤活性存在分子机制上的差异，提示这可能与其化学结 构不同有关。

本研究以人肺腺癌细胞株SPC-A-1作为细胞模型，研 究比较了丹参酮类4种化合物（丹参酮I、丹参酮IIA、隐 丹参酮、二氢丹参酮I）的细胞毒性作用，结果表明4种 化合物均能有效抑制细胞生长，且抑制作用呈明显的时 间、浓度依赖性。通过比较4种化合物作用24 h、48 h、 72 h后的IC50值可发现，4种化合物的细胞增殖抑制作用 强度依次为二氢丹参酮I、丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参 酮，此结果与叶因涛等[12]在宫颈癌HeLa细胞研究方面实 验结论基本一致，而在肺癌研究领域还无相关报道，本 研究对于开发用于治疗肺癌的丹参酮制剂有重要意义。 丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮及二氢丹参酮I均为丹参 二萜醌类化合物，其结构差异主要表现在A环与C环的不 同（图1）。本实验结果表明，A环为芳环的化合物（二 氢丹参酮I和丹参酮I）的细胞毒性明显强于A环为脂环的 化合物（丹参酮IIA和隐丹参酮），其原因可能是当A环 为芳环时，可影响整个分子的三维图像，表现为使B、C 两个环平面之间的两面夹角减小，从而增强化合物细胞 毒性[13]。对于呋喃环和醌类产生细胞毒性的作用机制， 长期以来的观点是其能产生自由基而引起DNA损伤。 2008年，Zhang[14,15]否认了这一假设，其研究结果显示丹 参酮IIA的呋喃氧并不产生自由基，而是通过与DNA双螺旋中腺嘌呤上的N形成氢键，改变DNA构型，导致RNAPII 磷酸化并降解，激活p53基因，从而产生诱导细胞凋 亡的作用；并进一步认为，当C环为二氢呋喃环时，由 于氧原子上的孤对电子不参与共轭，其电负性更强，更 易形成氢键，因此细胞毒性应强于C环为呋喃环的化合 物。这一结论虽可用于解释二氢丹参酮I的细胞毒性强 于丹参酮I，但却与丹参酮IIA细胞毒性强于隐丹参酮这 一实验结果相悖，说明这其中还存在有其它的因素，如 呋喃氧发挥细胞毒性作用是否仅为与DNA小沟结合，A 环为脂环时对呋喃氧及二氢呋喃氧的成键是否存在影响 等。因此，对于丹参酮类化合物的细胞毒性与其结构之 间的关系有待更深入的研究与探讨，方能更全面地阐释其细胞毒性的分子机理，为对其进行结构改造和修饰， 进而研制开发有效的创新抗癌药物提供理论与实验基础。

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