Magnetic nanoparticles for x sperm separation from equine semen. Field and commercial results

Abstract

Preselection of sex before conception has been one of the objectives pursued by scientists and breeders for many years. Within dairy and meat cattle industries there are productive reasons to calculate the financial benefit of preferring one sex. However, equines are subject to other variables i.e Polo horses where the industry prefers 100% mares (as in dairy cattle). The only replicable and efficient way up to now in separating the sperms that contain the X chromosome from those that contain the Y chromosome from a semen sample is through the use of cell sorting technique by high flow cytometer developed by Johnson in 1986 (Samper et. al, 2012). However, it has only been used commercially and at big scale in dairy cattle industry. The number of spermatozoa that can be effectively selected per hour in the flow cytometer has been a limitation for its mass application, especially for species that require a high number of sperms to inseminate a female, as it is the equine scenario (Panarace et. al, 2014). And also to consideration the level of damage that spermatozoa suffers during the process and the inability to get an appropriate frozen dose after sex sorting. The aim of this study was to test a new method of sex sorting spermatozoa that was also field friendly for using, none or less damage for spermatozoa and faster than cytometer. The use of magnetic beads in the nano scale could accomplish these features. The results showed that sperm parameters where mainly not affected comparing to control groups (not exposed to nano particles) and fertility tests went well on our first small scale inseminating mares.

Headnote

Summary

Preselection of sex before conception has been one of the objectives pursued by scientists and breeders for many years. Within dairy and meat cattle industries there are productive reasons to calculate the financial benefit of preferring one sex. However, equines are subject to other variables i.e Polo horses where the industry prefers 100% mares (as in dairy cattle).

The only replicable and efficient way up to now in separating the sperms that contain the X chromosome from those that contain the Y chromosome from a semen sample is through the use of cell sorting technique by high flow cytometer developed by Johnson in 1986 (Samper et. al, 2012). However, it has only been used commercially and at big scale in dairy cattle industry. The number of spermatozoa that can be effectively selected per hour in the flow cytometer has been a limitation for its mass application, especially for species that require a high number of sperms to inseminate a female, as it is the equine scenario (Panarace et. al, 2014). And also to consideration the level of damage that spermatozoa suffers during the process and the inability to get an appropriate frozen dose after sex sorting.

The aim of this study was to test a new method of sex sorting spermatozoa that was also field friendly for using, none or less damage for spermatozoa and faster than cytometer. The use of magnetic beads in the nano scale could accomplish these features. The results showed that sperm parameters where mainly not affected comparing to control groups (not exposed to nano particles) and fertility tests went well on our first small scale inseminating mares.

Introducción

La preselección de sexo antes de la concepción ha sido uno de los objetivos de científicos y criadores en programas de producción animal desde hace muchos años. En la industria de la producción de leche y carne bovina existen razones objetivas y productivas para calcular el beneficio económico de desear un sexo o el otro, sin embargo, en equinos este objetivo es más subjetivo y sujeto a otras variables.

En la actualidad, en la industria equina se realiza principalmente la determinación del sexo post concepción. Hasta ahora se han utilizado y probado variadas tecnologías y metodologías en equinos con este fin (para una revisión actualizada ver Aurich et al., 2014). Dentro de estas biotecnologías se puede mencionar la determinación temprana del sexo en embriones equinos a través de la detección del antígeno sexo específico macho H-Y, utilizando anticuerpos fluorescentes (Wood, 1988). Es importante notar que este método no es muy efectivo en embriones que han iniciado la formación del blastocele y aumentan los falsos negativos (Ramalho et. al, 2004). Dado que los embriones equinos entran al útero como mórula tardía ó blastocisto temprano, sólo una pequeña proporción de embriones recuperados podrían ser procesados por este método (Battut, et. al 1 997; Checura, et. al 2016).

Una segunda técnica es la detección de secuencias sexo específicas de ADN. Los embriones equinos son sensibles a la biopsia celular comparado con otras especies, ya que el desarrollo exitoso a nivel uterino depende de una cápsula acelular intacta (Stout et al., 2005). Sin embargo, recientemente han sido repor- tadas transferencias exitosas de embriones equinos biopsiados (Choi et al., 2010). La PCR utilizada para determinar el sexo embrionario trabaja con genes específicos localizados en el cromosoma Y. La técnica requiere equipo sofisticado así como personal capacitado, por lo tanto, es difícil su aplicación en condiciones de campo ó regiones dónde es requerida esporádicamente (Alonso et al., 2015).

De todos modos, la técnica más utilizada en la actualidad es la determinación del sexo fetal en útero. La identificación y ubicación ultrasonográfica del tubérculo genital en el feto es la primera opción cuando migra hacia la cola en la hembra y hacia el cordón umbilical en el macho, lo que permite la determinación del sexo fetal ecográficamente. El momento óptimo para la determinación del sexo fetal es entre el día 59 y el día 68 de gestación. Las tasas de éxito de la técnica son muy variables y dependen principalmente de la experiencia del examinador pero al ser una técnica sencilla, práctica y rápida actualmente en la mayoría de los programas de sexado fetal temprano con operadores entrenados la eficiencia es en general mayor al 96-98% (Curran y Ginther 1991; Bucca, 2005; Martínez et al., 2016).

La segunda opción ultrasonográfica es la identificación de las gónadas en el feto. A partir del día 100 de gestación, la combinación de la ultrasonografia transabdominal y transrectal permiten el examen visual del feto por completo, con una identificación real de los órganos sexuales primarios completamente desarrollados (Bucca, 2005).

Por último en la gestación avanzada se ha descripto el análisis del sexo fetal desde material fetal colectado de la circulación materna. Este método consiste en la identificación de ADN fetal libre circulante en sangre materna (De León et al., 2012). La ausencia de secuencias de cromosoma Y en plasma materno implica que el feto es hembra, sin embargo, esto también podría significar que es la consecuencia de no detectar ADN fetal libre en presencia de un feto macho. La significancia de esta técnica sería poder implementarla en estadios tempranos de gestación. En el presente no se sabe si células fetales del cinturón coriónico entran a circulación materna al momento de la invasión del endometrio, evento que ocurre al día 37 de gestación (Allen et al., 1975).

Según lo descrito anteriormente, a pesar que existen varias posibilidades para determinar el sexo de un concepto en el caballo, la mayoría de éstas demandan equipos de alto costo, experiencia y entrenamiento. O, por otro lado, son factibles de realizar a etapas de la gestación muy avanzada donde a veces no se puede tomar una decisión a tiempo para descartar un sexo no deseado o no es posible realizarlo bajo condiciones de campo; y si lo es lo hace ineficiente y costoso dado el tiempo invertido de trabajo e insumos previos a la toma de la decisión como ocurre en la determinación del sexo fetal por ultrasonografía a los 60 días de gestación (i.e programas de cría de caballos de polo en Argentina).

En cuanto a las técnicas preconcepción, la única forma reproducible y eficiente hasta hoy de separar espermatozoides que contienen el cromosoma X de los que contienen el cromosoma Y basado en el contenido de ADN desde una muestra de semen por medio del uso de la citometría de alto flujo desarrollada por Johnson en 1986. (Samper et. al, 2012).

Sin embargo, sólo ha sido utilizada a nivel comercial y a gran escala en bovinos. El número de espermatozoides que pueden ser eficazmente seleccionados por hora en el citómetro de flujo ha sido una limitante para su aplicación masiva especialmente en especies que requieren de un alto número de espermatozoides para inseminar una hembra cómo es el equino (Panarace et. al, 2014). Además se deben considerar las susceptibilidades de estos gametos a los variados procesos que ocurren durante el sexado por citometría de flujo (Garner, 2006).

Por otro lado la aplicación en condiciones de campo de semen congelado y sexado requiere de mayor investigación para producir muestras de semen de mejor calidad que las que existen en el presente para hacerlo comercialmente sustentable. (Clulow et. al 2009). Aunque muchas mejoras se han ido implementado con los años para aumentar las tasas de clasificación de espermatozoides y su calidad, aún menos del 50% del total de espermatozoides analizados son clasificados correctamente, con un 25% aproximado de espermatozoides X y 15 a 20% de espermatozoides Y. Consecuentemente el uso de semen sexado requiere de técnicas de inseminación artificial intracornual profunda a bajas dosis (Clulow et al., 2009).

Las tasas de gestación con semen fresco sexado tienen rangos entre 10 y 40%, cuando se ha utilizado entre 5 y 25 millones de espermatozoides vía inseminación profunda. La baja dosis y la alta dilución de la dosis inseminantes tienen por lo general efectos adversos en las tasas de gestación (Clulow et al., 2009). Morris, Hunter y Allen reportaron tasas de fertilidad aceptables utilizando un millón de espermatozoides suspendidos en 100 a 250 microlitros de diluyente junto con inseminación histeroscópica (Morris et al., 2000). En los últimos años, distintos trabajos independientes de Morris, Samper y Lascombes, inseminando entre 13 y 40 millones de espermatozoides y utilizando 15 padrillos diferentes, han resultado en tasas de gestación entre 40 y 60% usando inseminación profunda (Aurich et al., 2014).

Dentro de los métodos para mejorar la eficiencia y la calidad del semen después de haber sido sexado, está el uso de soluciones de amortiguación y coloides de centrifugación. Para tener un impacto en la industria, la muestra de semen de un padrillo debe tener la capacidad de ser transportado a un laboratorio que lo procese para sexado y posteriormente lo envíe al lugar de residencia de la yegua a ser inseminada. (Aurich et al., 2014).

Aunque una tasa de sexado lenta logra mejor clasificación y separación de espermatozoides X e Y, logrando una mayor pureza de la muestra, la eficiencia del proceso es afectada negativamente. Más aún, a mayor tiempo de procesado, menor calidad espermática de la muestra. El sexado por citometría de flujo es tiempo dependiente porque las células son clasificadas a tasas de entre 3000 y 5000 células por segundo. Estas tasas resultan en un tiempo de proceso de 1,5 horas para clasificar solamente 16 millones de células para inseminación o criopreservación (Clulow et al., 2009).

Un área de la medicina y la tecnología que recientemente ha explorado en la infertilidad masculina es la nano-tecnología o nanomedicina. Esta se refiere a la tecnología que trata o utiliza partículas sintetizadas a la escala de nanómetros o nano-escala (1 a 100 nm). Es interesante recordar que un nanómetro es una milmillonésima parte (10-9) de un metro (o una millonésima parte de un milímetro) y una dimensión de 100 nanómetros (el tamaño típico de un virus) es importante para la nanotecnología porque debajo de esta dimensión se pueden observar nuevas propiedades de la materia, en especial debido a las leyes de la física cuántica (Andrada, 2012). Estas nano-partículas pueden ser fabricadas en diferentes tamaños y composiciones y su biocompatibilidad con fluidos biológicos las convierten en un excelente dispositivo o herramienta para interacciones con células marcadas y no marcadas para propósitos que utilicen fluorescencia o magnetismo (Feugang et. al, 2015).

Es así como existen las técnicas de nano purificación espermática utilizando estas nano-partículas (NP) con procesos asociados de magnetismo, fluorescencia, inmuno-mediados o con marcadores de superficie de membrana logrando separar espermatozoides vivos de muertos y apoptóticos y así mejorar la infertilidad del semen procesado (Feugang et. al, 2015).

La tecnología de separación magnética de células (Magnetic Activated Cell sorting-MACS) es una técnica para la preparación de espermatozoides usada recientemente en técnicas de reproducción asistida. Esta tecnología, ha mostrado que puede separar espermatozoides motiles, viables y morfológicamente normales que despliegan una tolerancia significativa a la crio-preservación y tienen un mejor potencial de fertilización.

MACS provee pureza y recuperación óptima con resultados consistentes y fiables. Técnicamente es un procedimiento conveniente con un sistema fácil de aplicar en cualquier laboratorio. Provee de resultados rápidos dado los cortos períodos de incubación y la separación de las partículas después del procedimiento no es necesaria (Said et al., 2005; Makker et al., 2008;).

Otra característica que se ha estudiado es eí potenciái Zeta o potenciái eiectroquinético de los espermatozoides. Este es ei potenciai eiéctrico que se produce en ei piano de despiazamiento dei espermatozoide entre su membrana piasmática y ei entorno que io rodea. Los espermatozoides maduros poseen una carga eiéctrica entre -16mVy -20mV (Chan et. al, 2006).

Ei potenciai Zeta de ia fracción que contenía más de 80% de espermatozoides "Y" fue aproximadamente -16mV En cambio en ia fracción con más de 95% de espermatozoides "X" fue de -20mV En otras paiabras, ia carga neta negativa en ia superficie de ias céiuias espermáticas con cromosoma "X" es mayor que ia dei espermatozoide "Y" (Ishijima et. al, 1991).

Se puede resumir que existen y se han estudiado un gran número de tecnoiogías con ei fin de seieccionar y separar espermatozoides en distintas especies, entre eiias ei equino, con ios objetivos principaies de purificación para mejorar ias tasas potenciaies de fertiiización o para manipuiar ei sexo de ia progenie desde un momento pre-fertiiización. Sin embargo a pesar de ia variedad de tecnoiogías todavía no existe una que reúna características de ser económica, práctica y de fácii impiementación y disponibiiidad.

Esto generó ei objetivo de este estudio para ensayar una técnica accesibie y que no afecte ios parámetros espermáticos standard, para separar espermatozoides que contengan ei cromosoma X de Y en semen equino a través dei uso de Nano-partícuias magnéticas.

Los objetivos específicos pianteados fueron:

1. Determinar ia tasa de separación de espermatozoides X de espermatozoides Y post tratamiento.

2. Determinar ia tasa de espermatozoides viabies después dei proceso de sexado.

3. Determinar ia fertiiidad dei semen sexado inseminando yeguas con semen fresco sexado estabieciendo ei sexo de ios fetos por uitrasonografía transrectai a ios 125 días de gestación y ai parto.

Materiales y métodos

Protocolo de inseminación artificial

Se estabieció como dosis inseminante ia cantidad de 200 miiiones de espermatozoides con motiiidad progresiva y sexados que contengan ei cromosoma X (hembras). Esta dosis es obtenida después dei proceso de sexado con nanopartícuias magnéticas descrito por Ramírez et.ai (2017) utiiizando un dispositivo magnético específico (Figuras 1 y 2). Y ia técnica de inseminación artificiai (I.A) empieada ha sido ia intra-cornuai profunda a bajo voiumen.

Protocolo de Preparación de la Yegua para I.A

Todas las yeguas se controlaban ecográficamente desde el inicio de! celo cada 24 horas hasta que un folículo de mínimo 35mm y presencia de edema endometrial en grado 2 era observado. Ese día la yegua era inducida en la tarde (19 a 21 hrs) con algún análogo de GnRh como Deslorelina Acetato o Histerelina para que al día subsiguiente (36 horas después) se programara la colecta o envío del semen para ser procesado para sexaje y posterior I.A según descrito anteriormente. De esta manera todas las I.A se realizaron con al menos 36 horas de inducidas y la ovulación se controlo vía ecográfica durante ese mismo día o el día siguiente. Se inseminaron yeguas con semen fresco, refrigerado y congelado.

Resultados

Desde Octubre 2017 y hasta la fecha de entrega de este resumen se han logrado 108 preñeces en yeguas utilizando semen sexado de padrillos con NP Se ha utilizado semen fresco, refrigerado y congelado tanto para preñeces directas como en protocolos de transferencia embrionaria (T.E) y vitrificación de embriones. Las razas involucradas a la fecha han sido Chilena, Criolla, Cuarto de Milla, Polo, Holsteiner y Árabe. A continuación se presenta en la tabla N° 1 los datos tabulados por tipo de semen y técnica empleada y sus respectivas tasas de fertilidad. En la tabla N° 2 se muestran las proporciones de gestaciones confirmadas hembra por ecografía a los 60 y/o 125 días de gestación así como al parto según el caso. En la figura 3 la primera potranca nacida en el mundo por I.A con semen sexado con N.P

Conclusiones

La utilización de nano-partículas magnéticas es un método eficaz de separación de espermatozoides que contienen el cromosoma X de los que tienen el cromosoma Y confirmado por la prueba de FISH, Citometría De Flujo y qPCR con promedios sobre 90%.

La viabilidad espermática, no se vio afectada por la utilización de estas NP y su interacción con los espermatozoides equinos durante el proceso de sexado.

La motilidad total y progresiva evaluada por sistema de análisis computarizado AndroVision® no mostró diferencias entre grupo control y sexado tanto antes como después del proceso de congelación.

Los parámetros de Motilidad, VSC, VSL, VAP Capacitación y PY no mostraron diferencias entre semen control y sexado después de la congelación. El parámetro de fragmentación de ADN si mostro un mayor nivel de fragmentación en el grupo sexado según la prueba de selección espermática.

En los ensayos preliminares in vivo, el semen sexado utilizando NP magnéticas mantuvo su capacidad fertilizante y no generó pérdidas gestacionales tempranas.

La proporción del sexo hembra logrado en las gestaciones se mantiene sobre 90% utilizando las NP magnéticas como medio de sexado de semen equino para separar espermatozoides con cromosoma X.

References

Referencias

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