Sensitivity of MCF-7 cells with differential expression of S6K1 isoforms to the regulatory impact of fibroblasts

Abstract

Aim. To investigate the involvement of mTOR/S6K1 cell signaling network, with focus on S6K, in response of tumor cells to regulatory impact of fibroblasts. Methods. Cell culture, including co-cultivation of fibroblasts and tumor cells, immunofluorescence analysis, Western blot analysis, assessment of cell migration by scratch test, and transformation of multicellular spheroid into monolayer cell colony. Results. The present work showed the positive effect of stromal cells on the phosphorylation level of the components of mTOR/S6K1 signaling cascade: p85S6K1, p70S6K1 and mTOR in human breast adenocarcinoma MCF-7 cells. To determine, which of the S6K1 isoforms, p85S6K1, p70S6K1, or p60S6K1, is the most sensitive to the extracellular environment, stable MCF-7 cell lines with edited expression of S6K1 isoforms were used. It was found that selective expression of p60S6K1 led to the changes in morphological features of tumor cells under both two- and three-dimensional culture conditions. These cells also exhibited high levels of focal adhesion kinase (FAK) phosphorylation and large protein content of Zo-1, CD29, CD44 compatible with their high migration potential in the scratch test. Besides, the cells, selectively expressing p60S6K1, were resistant to fibroblast-producing factors and rapamycin. It was also demonstrated that fibroblasts increased tumor cell motility in scratch test and spheroid outspreading assay under co-cultivation conditions in paracrine manner, whereas the direct contact of tumor spheroids with the fibroblast monolayer significantly reduced the velocity of spheroid outspreading. Conclusions. The data obtained indicate that not only the differential expression of S6K1 isoforms in MCF-7 cells but also their ratio are important signaling parameters determining cell survival and response to microenvironment factors.

Alternate abstract:

Мета. Дослідити участь mTOR/S6K1 сигнальної мережі пухлинних клітин у їхній відповіді на регуляторний вплив фібробластів. Методи. Культура клітин, включаючи спів-культивування фібробластів та пухлинних клітин, імунофлуоресцентний аналіз, вестерн-блот-аналіз, оцінка міграційної активності пухлинних клітин методом подряпин та перетворення багатоклітинного сфероїду в одношарову клітинну колонію. Результати. Представлена робота продемонструвала позитивний вплив стромальних клітин на рівень фосфорилювання ланокmTOR/S6K1сигнального каскаду: p85S6K1, p70S6K1 та mTORпухлинних клітин лінії MCF-7. Щоб визначити, яка з ізоформ S6K1: p85S6K1, p70S6K1 чи p60S6K1 може бути найбільш чутливою до дії позаклітинного середовища, були використані стабільні клітинні лінії на основі клітин MCF-7 з редагованою експресією ізоформ S6K1. Таким чином, було встановлено, що селективна експресія p60S6K1 призводила до зміни морфологічних особливостей пухлинних клітин за умов дво- та тривимірної культури. Ці клітини також демонстрували високий рівень фосфорилювання кінази фокальної адгезії та високий вміст білків Zo-1, CD29, CD44, що пояснює їх високий міграційний потенціал в тесті на подряпини. Крім того, клітини, що селективно експресують p60S6K1, були стійкими як до факторів, що продукують фібробласти так і до рапаміцину. Також, було продемонстровано, що фібробласти підвищують рухливість пухлинних клітин в тесті на подряпини та розпластуванні сфероїдів в умовах спів-культивування паракриновим шляхом, тоді як безпосередній контакт пухлинних сфероїдів з моношаром фібробластів значно знижував швидкість розпластування сфероїдів. Висновки. Аналіз поведінки пухлинних клітин із зміненою експресією ізоформ S6K1 виявив, що для життєдіяльності клітин та їхньої відповіді на вплив найближчого оточення важливі не тільки експресія певних ізоформ, а й їх співвідношення в клітині.

Alternate abstract:

Цель. Исследовать участие mTOR/S6K1 сигнальной сети опухолевых клеток в их ответе на регуляторное влияние фибробластов. Методы. культура клеток, включая со-культивирование фибробластов и опухолевых клеток, иммунофлуоресцентный анализ, вестерн-блот-анализ, оценка миграционной активности опухолевых клеток методом царапин и преобразования многоклеточного сфероида в однослойную клеточную колонию. Результаты. Представленная работа продемонстрировала положительное влияние стромальных клеток на уровень фосфорилирования звеньев mTOR / S6K1 сигнального каскада: p85S6K1, p70S6K1 и mTOR опухолевых клеток линии MCF-7. Чтобы определить, какая из изоформ S6K1: p85S6K1, p70S6K1 или p60S6K1 может быть наиболее чувствительной к действию внеклеточногоокружения, были использованы стабильные клеточные линии на основе клеток MCF-7 с редактированной экспрессией изоформ S6K1. Таким образом, было установлено, что селективная экспрессия p60S6K1 приводила к изменению морфологических особенностей опухолевых клеток в условиях двух- и трехмерной культуры. Эти клетки также демонстрировали высокий уровень фосфорилирования киназы фокальной адгезии и высокое содержание белков Zo-1, CD29, CD44, что объясняет их высокий миграционный потенциал в тесте на царапины. Кроме того, клетки, селективно экспрессирующие p60S6K1, были устойчивыми как к факторам, которые продуцируют фибробласты так и к рапамицину. Также, было продемонстрировано, что фибробласты повышают подвижность опухолевых клеток в тесте на царапины и распластывание сфероидов в условиях со-культивирования паракринным путем, тогда как непосредственный контакт опухолевых сфероидов с монослоем фибробластов значительно снижал скорость распластывание сфероидов. Выводы. Анализ поведения опухолевых клеток с измененной экспрессией изоформ S6K1 обнаружил, что для жизнедеятельности клеток и их ответа на факторы микроокружения важны не только экспрессия определенных изоформ, но и их соотношение в клетке.