Microtubule Structure & Dynamics: Insights from C. elegans

Abstract

Microtubules are long, slender polymers of the protein tubulin that cells use to construct the cytoskeleton, the mitotic spindle, axonemes, and neuronal processes. These polymers are not static. Rather, they are constantly broken down and rebuilt as cells grow, divide, and differentiate. This process is called the dynamic instability of microtubules, which is a conserved and fundamental mechanism in eukaryotes. However, microtubules from different species diverge in their growth rates and lattice structures. Therefore, we do not know what limits microtubule growth, what determines microtubule structure, or whether the mechanisms of dynamic instability are universal. To approach this challenge, I turned to the nematode C. elegans, which stands out in the microcosm of microtubule morphology. First, its microtubules lack the textbook 13 protofilament architecture found in most species studied to date, including mammals. Instead, its cells harbour smaller microtubules with only 11 protofilaments. Second, its microtubules grow nearly two orders of magnitude faster than those of other eukaryotes. I reasoned that studying the microtubules of C. elegans would yield critical insights into microtubule structure and dynamics.

Using a reconstitution approach, I found that C. elegans microtubules were intrinsically fast-growing. To understand how sequence divergence translates to fast growth, I turned to cryo-electron microscopy. In combination with single-particle reconstruction techniques, I was able to solve the 3D structure of C. elegans microtubules to 4.8 Å. This revealed that the divergent residues localize to inter-tubulin lateral contacts. Furthermore, a typically unstructured loop therein was resolved in C. elegans compared to published mammalian microtubule structures. Indeed, a molecular dynamics simulation of tubulin performed by the Sept lab showed that those residues were more likely to form stable secondary structures. By applying the Arrhenius equation to microtubule growth, I confirmed that C. elegans tubulin had a higher free energy in solution. Finally, an analysis of tubulin geometry revealed that the C. elegans 11 protofilament microtubules were supertwisted in vitro. I confirmed this observation in electron tomograms of fixed embryos (prepared by the Müller-Reichert lab) by developing a novel 3D analysis technique. Ultimately, this study revealed that (1) the ordering of lateral contact loops limits microtubule growth, and (2) a complex metazoan can thrive with supertwisted microtubules.

Alternate abstract:

Les microtubules sont de longs polymères de la protéine tubuline que les cellules utilisent pour construire le cytosquelette, le fuseau mitotique, les axonèmes, et les neurites. Ces polymères ne sont pas statiques. Au contraire, ils sont constamment désassemblés et reconstruits au cours de la croissance, la division et la différenciation cellulaire. Ce processus est un mécanisme conservé et fondamental chez les eucaryotes qu'on appelle l'instabilité dynamique des microtubules. Les microtubules de différentes espèces divergent dans leurs vitesses de croissance et dans leurs structures. Ainsi, nous ne savons pas ce qui limite la croissance des microtubules, ce qui détermine leur structure et d'autant moins si les mécanismes de l'instabilité dynamique sont universels. Je me suis donc tourné vers les microtubules du nématode C. elegans, bien uniques pour leur morphologie. Premièrement, ils contiennent 11 protofilaments, contrairement aux microtubules chez la majorité des espèces étudiées, qui en contiennent 13. Deuxièmement, les microtubules de C. elegans croissent beaucoup plus rapidement que ceux d'autres eucaryotes. J'ai donc pensé que l'étude des microtubules de C. elegans rendrait une perspective importante sur les microtubules.

Grâce à un système de reconstitution in vitro, j'ai trouvé qu'une croissance rapide est une propriété intrinsèque des microtubules de C. elegans. Pour comprendre comment la particularité de séquence peptidique produit une croissance rapide, je me suis tourné vers la cryo-microscopie électronique. Combinant ceci avec une technique de reconstruction, j'ai réussi à déterminer la structure en 3D des microtubules de C. elegans à 4.8 Å. Ceci a révélé que les résidus divergents se localisent aux contacts inter-tubulines latéraux. Dans ces contacts, une région typiquement désordonnée chez les mammifères est ordonnée chez C. elegans. En effet, une simulation de la dynamique moléculaire de la tubuline par le laboratoire du Dr Sept a démontré que ces résidus sont plus susceptibles de former des structures secondaires stables. En appliquant l'équation d'Arrhenius à la croissance des microtubules, j'ai confirmé que la tubuline de C. elegans a une plus grande énergie libre en solution. Finalement, une analyse de la géométrie de la tubuline a révélé que les microtubules à 11 protofilaments de C. elegans sont surenroulés in vitro. J'ai confirmé cette observation en analysant des tomogrames d'embryons (préparées par le laboratoire du Dr Müller-Reichert). Finalement, cette étude a révélé que (1) la structure secondaire des résidus participant aux contacts inter-tubulines latéraux limite la croissance des microtubules et (2) un métazoaire complexe peut prospérer en ayant des microtubules surenroulés.