Genetic diversity and molecular characterization of Cucumber mosaic cucumovirus (CMV) subgroup II infecting Spinach (Spinacia oleracea) and Pea (Pisum sativum) in Pothwar region of Pakistan

Abstract

Cucumber mosaic cucumovirus (CMV) é uma tremenda ameaça aos vegetais em todo o mundo, inclusive no Paquistäo. O presente trabalho foi conduzido para investigar a variabilidade genética de isolados de CMV infectando vegetais de ervilha e espinafre na regiäo de Pothwar, Paquistäo. Pesquisas com base em sorologia durante 2016-2017 revelaram 31,70% da incidencia geral da doença por CMV em safras de ervilha e espinafre. O ensaio de imunoabsorçâo enzimática em sanduíche de anticorpo triplo (TAS-ELISA) revelou que todos os isolados positivos pertencem ao subgrupo II do CMV. Dois cDNA selecionados de amostras positivas para ELISA representando cada safra de ervilha e espinafre foram amplificados por PCR (ca.1100 pb) e sequenciados correspondendo ao gene CMV CP que compartilhou 93,7% de identidade de nucleotídeo um com o outro. Ambas as sequencias de isolados de ervilha CMV (AAHAP) e espinafre (AARS) do Paquistäo foram submetidas ao GenBank como nos de acesso. MH119071 e MH119073, respectivamente. A análise BLAST revelou 93,4% de identidade de sequencia do isolado AAHAP com SpK (KC763473) do Irä, enquanto o isolado AARS compartilhou a identidade máxima (94,5%) com a cepa 241 (AJ585519) da Austrália e agrupada com alguns isolados de referencia do subgrupo II de CMV do Reino Unido (Z12818) e EUA (AF127976) em uma reconstruçâo filogenética vizinha. Um total de 59 sitios polimórficos (segregantes) (S) com diversidade de nucleotídeos (n) de 0,06218 foi evidente, enquanto nenhum evento INDEL foi observado em isolados do Paquistäo. A distancia evolutiva de isolados de CMV do Paquistäo foi registrada como 0,0657 entre si e 0,0574-0,2964 com outros isolados de CMV relatados em outras partes do mundo. Um fluxo genico frequente (Fst = 0,30478 < 0,33) foi observado entre os isolados de CMV do Paquistäo e relatados anteriormente. Na análise de diferenciaçâo genética, os valores de tres testes estatísticos baseados em permutaçâo viz, Z (84,3011), Snn (0,82456) e Ks · (4,04042) näo foram significativos. A análise estatística revelou os valores 2,02535, 0,01468 e 0,71862 de Tajima's D, Fu, & Li's F · e D · respectivamente, demonstrando que a populaçâo de CMV está sob seleçâo de balanceamento.

Alternate abstract:

Cucumber mosaic virus (CMV) is a tremendous threat to vegetables across the globe, including in Pakistan. The present work was conducted to investigate the genetic variability of CMV isolates infecting pea and spinach vegetables in the Pothwar region of Pakistan. Serological-based surveys during 2016-2017 revealed 31.70% overall CMV disease incidence from pea and spinach crops. Triple-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (TAS-ELISA) revealed that all the positive isolates belong to CMV subgroup II. Two selected cDNA from ELISA-positive samples representing each pea and spinach crops were PCR-amplified (ca 1100 bp) and sequenced corresponding to the CMV CP gene which shared 93.7% nucleotide identity with each other. Both the sequences of CMV pea (AAHAP) and spinach (AARS) isolates from Pakistan were submitted to GenBank as accession nos. MH119071 and MH119073, respectively. BLAST analysis revealed 93.4% sequence identity of AAHAP isolate with SpK (KC763473) from Iran while AARS isolate shared maximum identity (94.5%) with the strain 241 (AJ585519) from Australia and clustered with some reference isolates of CMV subgroup II from UK (Z12818) and USA (AF127976) in a Neighbourjoining phylogenetic reconstruction. A total of 59 polymorphic (segregating) sites (S) with nucleotide diversity (n) of 0.06218 was evident while no INDEL event was observed in Pakistani isolates. The evolutionary distance of Pakistani CMV isolates was recorded as 0.0657 with each other and 0.0574-0.2964 with other CMV isolates reported elsewhere in the world. A frequent gene flow (Fst = 0.30478 <0.33) was observed between Pakistani and earlier reported CMV isolates. In genetic differentiation analysis, the value of three permutation-based statistical tests viz; Z (84.3011), Snn (0.82456), and Ks· (4.04042) were non-significant. The statistical analysis revealed the values 2.02535, 0.01468, and 0.71862 of Tajima's D, Fu, & Li's F· and D· respectively, demonstrating that the CMV population is under balancing selection.