Screening Obesogens in Aquatic Model Organisms

Abstract

Os lípidos são um dos principais componentes nos seres vivos. Estes possuem, entre outras, funções de armazenamento de energia, participam na constituição das membranas biológicas, são utilizados como mensageiros intracelulares, cofatores enzimáticos e percursores na síntese de produtos celulares. Nos últimos anos, o aumento da incidência da obesidade nos países ocidentais, esteve na base de uma nova hipótese que sugere a existência de fatores de risco ambientais, tais como poluentes, que poderão promover este fenómeno. Vários químicos, designados de disruptores endócrinos (EDCs), possuem a capacidade de interferir com a fisiologia dos organismos, alterando diversos processos biológicos. Recentemente, alguns EDCs foram descritos como tendo a capacidade de modelar a homeostasia lipídica em várias espécies de vertebrados e invertebrados. Estes químicos foram designados obesogénios. O principal mecanismo associado à desregulação da homeostasia lipídica parece envolver a modelação inapropriada de recetores nucleares (NRs). Os poluentes com propriedades obesogénicas mais estudados em mamíferos são os organoestanhos tributilestanho (TBT) e trifenilestanho (TPT), estes são reconhecidos como ligandos dos NRs, recetor ativado pelo proliferador de peroxissomas gamma (PPARγ) e recetor X do ácido retinoico (RXR). O PPARγ, que forma um heterodímero com o RXR, possui um papel crucial na adipogénese. Enquanto o ortólogo do PPAR foi reportado apenas em deuterostómios e moluscos, o RXR encontra-se presente na grande maioria dos metazoários. Contudo, a informação relativa ao PPAR em invertebrados é escassa, o que dificulta a compreensão da(s) função(s) deste fator de transcrição e a sua possível dirupção por EDCs

O trabalho desenvolvido durante esta tese pretende preencher as lacunas identificadas anteriormente e expandir o conhecimento relativo à perturbação da homeostasia lipídica associado com EDCs, focando-se em particular na modelação de NRs pelos organoestanhos, obesogénios modelo em mamíferos. Primeiramente focouse na caracterização funcional dos PPARs num amplo conjunto de taxa vertebrados e invertebrados, explorando os resultados num contexto evolutivo e toxicológico. Inicialmente isolou-se e efetuou-se a caracterização funcional de um ortólogo do PPAR em moluscos recorrendo a análises de genómica comparativa, filogenia e ensaios de transativação. A espécie selecionada para o estudo foi o gastrópode Patella depressa, cujo PPAR transativou na presença de presumíveis ligandos naturais, como o ácido araquidônico (ARA) e eicosapentaenoico (EPA). Posteriormente avaliou-se a resposta deste recetor na presença de TBT e TPT. Ambos os organoestanhos reprimiram o PPAR de P. depressa tanto em monómero como em heterodímero (PPAR/RXR).Seguidamente testaram-se os efeitos in vivo no perfil de ácidos gordos de P. depressa quando exposto a níveis ambientalmente relevantes de TBT. A exposição a diferentes concentrações de TBT (100 e 250 ng Sn/L) revelou alterações estatisticamente significativas no perfil de ácidos gordos, reforçando as observações in vitro

Antes do presente trabalho não existia informação disponível relativa aos efeitos dos organoestanhos no metabolismo lipídico de equinodermes ou qualquer caracterização do PPAR nestes organismos. Tendo em conta que o PPAR está previsto no genoma deste taxa, e considerando a sua posição filogenética, foi isolado e funcionalmente caracterizado um PPAR de Paracentrotus lividus.

Alternate abstract:

Lipids display key functions in all living organisms. They are used as energy storage, building blocks of biological membranes, precursors in the synthesis of important cellular products, intracellular messengers, enzymes cofactors, among others. In recent years the rise in the obesity rates in western countries led to the hypothesis that environmental risk factors, such as pollutants, are potentially involved in the prevalence of the phenomenon. Today, it is well established that several chemicals, known as endocrine disrupting chemicals (EDCs), can interfere with organism’s physiology, impacting key biological processes. Recently, some EDCs have been described to modulate lipid homeostasis in both vertebrates and non-vertebrates species. These chemicals have been named as obesogens. The main mechanism of action associated with lipid homeostasis disruption seems to involve the inappropriate modulation of nuclear receptors (NRs). One of the best-known examples of obesogens in mammals are organotins. Tributyltin (TBT) and triphenyltin (TPT) are known ligands for mammalian NRs peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) and retinoid X receptor (RXR), which displays a key role in adipogenesis. Whereas PPAR orthologues have been reported in deuterostomes and molluscs, RXR is present in most of metazoans. Yet, there is a paucity of data on PPAR functional characterization outside vertebrates, which hampers a better understanding of the role of this transcription factor and its putative disruption by EDCs.

The work developed in the frame of this thesis aims to fill the gaps identified above and expand our knowledge on the taxonomic scope of lipid homeostasis perturbation by environmental chemicals, focusing in particular in the modulation of NRs by the model mammalian obesogens organotins. The present work is the first to functionally characterize PPARs in a large set of vertebrate and non-vertebrate taxa and discuss the findings in an evolutionary and toxicological context. Our first approach involved the isolation and the first functional characterization of PPAR orthologues in molluscs using comparative genomics, phylogeny and transactivation assays. The gastropod, Patella depressa, was the target species. PPAR alone transactivated in the presence of putative natural ligands, arachidonic acid (ARA) and eicosapentaenoic acid (EPA). We then addressed the response in the presence of TBT and TPT. Both organotins repress P. depressa PPAR alone and when tested in heterodimer PPAR/RXR. We then tested the in vivo effects of environmentally relevant levels of TBT in P. depressa fatty acid profile. Exposure to TBT at 100 and 250 ng Sn/L supported the in vitro findings, since statistically significant alterations were observed in the fatty acid profile.

Before the present work no information was available regarding the effect of organotins in lipid metabolism or PPAR characterization in echinoderms. Given that PPAR was also genome predicted in this taxa, and considering its phylogenetic position, we isolated and functionally characterized one PPAR from Paracentrotus lividus. Similar to molluscs, transactivation assays showed that a mixture of fatty acids, the putative natural ligands, transactivate expression via the heterodimer PPAR/RXR. Interestingly, TBT and TPT also behaved as repressors of Paracentrotus lividus PPAR/RXR.