Le rôle du cholestérol dans l’infection de cultures cellulaires d’insectes par un baculovirus

Abstract

Les baculovirus sont d'un grand intérêt pour la production de bioinsecticides ainsi que pour la synthèse de protéines recombinantes par les cellules d'insectes. Les cellules d'insectes, contrairement à celles des mammifères, ont la particularité d'être auxotrophes aux stérols, c'est-à-dire qu'elles doivent acquérir ces derniers à partir du milieu de culture puisqu'elles sont incapables de les synthétiser. Malgré ce fait, plusieurs lignées cellulaires d'insectes ont été adaptées à des milieux sans ajout lipidique et la lignée cellulaire de Spodoptera frugiperda a été adaptée, dans notre laboratoire, au milieu Mitsuhashi-Maramorosch N°8 sans sérum (Sf9 MM8-SF). Bien que ces cellules conservent un excellent taux de croissance, les virus des polyédroses nucléaires (NPV) ne peuvent s'y multiplier. Le sérum de veau fœtal (SVF) a longtemps permis d'y remédier. Par contre, de nombreux désavantages liés à son utilisation ont conduit à privilégier l'ajout de lipides commerciaux. Cependant, des anomalies morphologiques ont été notées chez les NPV produits chez les cellules cultivées en présence d'un mélange lipidique commercial. D'autre part, un ajout de cholestérol seul à une concentration de 20 J.Jg/ml s'est avéré suffisant pour obtenir une infection virale normale et complète.

Tout en démontrant que l'ajout de cholestérol comme seule source lipidique était suffisant à une infection normale et complète, le présent travail a été dirigé vers l'importance et le rôle du cholestérol dans l'infection de cellules d'insectes par un baculovirus. L'utilisation d'un marqueur spécifique au cholestérol, le filipin, a permis de démontrer par cytométrie en flux, ainsi que par microscopie à fluorescence, que le cholestérol, ajouté aux cellules, s'insère dans la membrane plasmique et que celui-ci se concentre en agrégats à la surface cellulaire, ce qui pourrait représenter des micro-domaines « rafts ». L'ajout de cholestérol au moment de l'infection, et demeurant en contact avec les cellules au cours de l'infection, est amplement suffisant à une infection virale complète. L'ajout continuel de cholestérol au fil des passages ne s'est pas avéré avantageux. Ceci représente donc une diminution des coOts dans la production de baculovirus à grande échelle.

Puisque l'ensemble de nos résultats ont clairement démontré l'importance du cholestérol dans l'infection baculovirale, nos travaux ont porté, par la suite, sur le rôle du cholestérol dans cette infection. Nous avons démontré que le cholestérol occupe un rôle, directement ou indirectement, au cours des premières étapes de l'interaction• entre le virus et la cellule, possiblement au niveau de l'attachement du virus aux récepteurs cellulaires eVou au cours de la fusion des membranes. Des expériences menées à l'aide de la transfection de cellules Sf9 MM8-SF par l'ADN d'AcMNPV ont permis de démontrer que le cholestérol ne semblerait pas jouer de rôle dans la réplication ni dans la synthèse de nouveaux virus ou de la libération de virus infectieux des cellules. En effet, les virus produits par les cellules Sf9 MM8-SF suite à une transfection en absence de cholestérol se sont avérés infectieux autant in vitro, chez les cellules Sf9 maintenues en présence de sérum de veau foetal (SVF), qu'in vivo, chez les larves de Galleria mellonella.

Ces résultats ont permis de démontrer toute l'importance du cholestérol dans l'infection baculovirale et ont conduit à une meilleure compréhension de son rôle.

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Baculoviruses are of great interest for the production of bioinsecticides as well as for the synthesis of recombinant proteins by insect cells. Insect cells, unlike those of mammals, have the particularity of being auxotrophic to sterols, i.e. they must acquire them from the culture medium since they are unable to synthesize them. . Despite this fact, several insect cell lines have been adapted to media without added lipids and the Spodoptera frugiperda cell line has been adapted, in our laboratory, to Mitsuhashi-Maramorosch N°8 medium without serum (Sf9 MM8-SF). . Although these cells maintain an excellent growth rate, nuclear polyhedrosis viruses (NPV) cannot multiply in them. Fetal calf serum (FCS) has long been a remedy. On the other hand, numerous disadvantages linked to its use have led to favoring the addition of commercial lipids. However, morphological abnormalities were noted in NPVs produced in cells cultured in the presence of a commercial lipid mixture. On the other hand, an addition of cholesterol alone at a concentration of 20 J.Jg/ml proved to be sufficient to obtain a normal and complete viral infection.

While demonstrating that the addition of cholesterol as the sole lipid source was sufficient for normal and complete infection, the present work has been directed to the importance and role of cholesterol in baculovirus infection of insect cells. The use of a marker specific to cholesterol, filipin, has made it possible to demonstrate by flow cytometry, as well as by fluorescence microscopy, that cholesterol, added to cells, is inserted into the plasma membrane and that this concentrates in aggregates on the cell surface, which could represent "raft" micro-domains. Adding cholesterol at the time of infection, and remaining in contact with the cells during infection, is more than enough for complete viral infection. Continual addition of cholesterol over passages has not been shown to be beneficial. This therefore represents a cost reduction in the production of baculovirus on a large scale.

Since all of our results have clearly demonstrated the importance of cholesterol in baculoviral infection, our work then focused on the role of cholesterol in this infection. We have demonstrated that cholesterol plays a role, directly or indirectly, during the first stages of the interaction• between the virus and the cell, possibly at the level of the attachment of the virus to the cellular receptors eVou during the fusion of the membranes. Experiments conducted using the transfection of Sf9 MM8-SF cells with AcMNPV DNA demonstrated that cholesterol does not appear to play a role in replication or in the synthesis of new viruses or the release cells infectious virus. Indeed, the viruses produced by the Sf9 MM8-SF cells following a transfection in the absence of cholesterol proved to be infectious both in vitro, in the Sf9 cells maintained in the presence of fetal calf serum (FCS), and in vivo, in Galleria mellonella larvae.

These results demonstrated the importance of cholesterol in baculoviral infection and led to a better understanding of its role.