Construção de Mutantes em RNases em Enterococcus

Abstract

A expressão génica pode ser regulada a diferentes níveis. Nos últimos anos têm surgido imensos exemplos de regulação pós-transcricional quer a nível do processamento, quer da degradação (estabilidade) do RNA, a qual permite uma adaptação rápida a alterações no meio extracelular.

No processo de invasão do hospedeiro, as bactérias patogénicas atravessam uma série de condições físico-químicas muito distintas a que têm de fazer frente e se adaptar. Neste contexto, na adaptação a condições de stress, estão envolvidos diversos mecanismos de regulação pós-transcricional. No entanto, em enterococos, bactérias Gram-positivas presentes em diversos ambientes e que tem emergido nos últimos anos como causadores de infecções nosocomiais graves, não foi ainda estudada a função deste tipo de regulação em geral e qual a sua relação com a patogenicidade. Assim, este trabalho teve como objectivos a construção de mutantes em ribonucleases, enzimas cruciais na regulação pós-transcricional, nomeadamente, em duas exoribonucleases, PNPase e RNase R, e em duas endoribonucleases, RNase III e RNase J1.

O trabalho efectuado, devido à diversidade das dificuldades encontradas com cada um dos mutantes, abrangeu uma grande gama de técnicas de biologia molecular e de genética, quer em Escherichia coli, quer em Enterococcus faecalis.

Assim, o 'mutante' da RNase III encontra-se na última etapa do protocolo, enquanto os 'mutantes' das outras RNases se encontram na fase de confirmação das construções a utilizar para integração em enterococos (PNPase e RNase R) ou ainda na primeira clonagem (RNase J1). Os resultados obtidos até este momento, parecem indicar que a RNase III é essencial em enterococos, tal como acontece em Bacillus subtilis;no entanto, estudos adicionais serão necessários para confirmação deste resultado.

Alternate abstract:

Gene expression can be regulated at different levels. In the past few years several examples of post-transcriptional regulation have arise regarding the processing and degradation (stability) of RNA molecules, which allows a rapid adaptation to changing environments.

When invading the host, pathogenic bacteria have to go through several and very distinct extracellular conditions to which they have to adapt in order to survive. In this adaptation to foreign stress causing factors are involved various mechanisms of post-transcriptional regulation. However in enterococci, Gram-positive cocci present in a large variety of habitats and that have become one of the leading cause of nosocomial infections, the function of this kind of regulation and its relation with pathogenicity has not been studied. Thus the goal of this work was the creation of bacteria mutants on ribonucleases namely on the exoribonucleases PNPase and RNase R genes and on the endoribonucleases RNase III and RNase J1. These RNases are enzymes of vital importance on the post-transcriptional regulation processes.

Due to the diverse difficulties encountered during this work, it came to involve a great variety of molecular and genetic techniques in bothEscherichia coli and Enterococcus faecalis.

At the moment the RNase III 'mutant' is at the final stage of the protocol while the other RNases 'mutants' are still at the construction confirmation stage before transforming enterococci (PNPase and RNase R) or still at the first cloning step (RNase J1). The results obtain so far seem to point RNase III as essencial, similarly to what is described in Bacillus subtilis.Nevertheless further studies will be necessary to prove this hypothesis.