Transformation genetique et determination du caryotype electrophoretique du champignon phytopathogene Nectria galligena

Nous avons génétiquement transformé des protoplastes du champignon pathogène Nectria galligena à l'aide de quatre vecteurs contenant le gène de résistance à l'hygromycine B. Pour produire les protoplastes, nous avons fait digéré la paroi cellulaire de conidies germées avec le cocktail d'enzymes lytiques Novozyme 234. Nos résultats indiquent que le sucrose est préférable aux autres stabilisants osmotiques testés pour régénérer la paroi cellulaire des protoplastes. Des fréquences de transformation allant jusqu'à 115 transformants/μg d'ADN/10⁸ protoplastes ont été obtenues avec le plasmide pAN7-1. Des hybrydations de type Southern ont confirmé l'insertion d'ADN étranger et nous ont permis de caractériser les événements de transformation. L'insertion du plasmide est aléatoire. Dans tous les transformants analysés, plusieurs copies du plasmide ont été insérées au génôme du N. galligena. Le système de transformation développé nous a permis d'exprimer le gène de la green fluorescent protein (GFP) chez une souche du N. galligena. Nous avons pu séparer jusqu'à neuf bandes d'ADN chromosomique chez la souche POF 940019-1 de N. galligena. Ces bandes ont des tailles variant de 1 à plus de 10 Mb. Chez cette souche, nous estimons que la taille du génôme de N. galligena gena est de 30–40 Mb.

Alternate abstract:

We genetically transformed protoplasts of the pathogenic fungus Nectria galligena using four vectors containing the hygromycin B resistance gene. To produce the protoplasts, we digested the cell wall of germinated conidia with the enzyme cocktail. Novozyme 234 lytics. Our results indicate that sucrose is preferable to other osmotic stabilizers tested for regenerating the protoplast cell wall. Transformation frequencies of up to 115 transformants/μg DNA/108 protoplasts were obtained with the pAN7-1 plasmid. Southern hybridizations confirmed the insertion of foreign DNA and allowed us to characterize the transformation events. Plasmid insertion is random. In all the transformants analyzed, several copies of the plasmid were inserted into the N. galligena genome. The transformation system developed allowed us to express the green fluorescent protein (GFP) gene in a strain of N. galligena. We were able to separate up to nine chromosomal DNA bands in N. galligena strain POF 940019-1. These tapes have sizes varying from 1 to more than 10 Mb. In this strain, we estimate that the genome size of N. galligena gena is 30–40 Mb.