Polyfunctional Calcium Phosphate Nanoparticles as a Novel Vaccine Platform Against HIV-1

Abstract

Synthetic nanoparticles functionalized with stabilized trimers of the HIV-1 envelope glycoprotein (Env) have become a major focus in AIDS vaccine research. The additional incorporation of T helper cell epitopes into such nanoparticles might recruit pre-existing CD4+ T cell responses induced by childhood vaccinations to provide intrastructural help (ISH) for Env-specific B cells upon immunization. In this study, calcium phosphate nanoparticles (CaPs), that encapsulate an immunodominant Tetanus Toxoid epitope (p30) and display Env trimers on the surface (T helper CaPs), were evaluated in preclinical vaccine trials. T helper CaPs induced the activation of Env-specific naïve B cells in vitro, which was not observed with soluble Env trimers. Immunization with T helper CaPs resulted in significantly stronger Env-specific humoral immune responses via ISH in mice that were immunized in advance with a licensed Tetanus vaccine. The magnitude of anti-Env antibody levels in ISH mice was comparable to a control group immunized with CpG-adjuvanted CaPs. In contrast to CpG, the induction of immune mechanisms suspected to increase the susceptibility for HIV infection was bypassed by harnessing ISH. Having provided evidence that the utilization of T helper CaPs resulted in versatile, immunomodulatory features, the nanoparticle design was improved by an orthogonal Env coupling mechanism (oCaPs). To this end, a genetically encoded aldehyde-tag (LCTPSR) was introduced at the C-terminus of native-like, soluble Env trimers. The tag-associated cysteine is post-translationally converted into a formylglycine harboring an aldehyde group, which was confirmed by mass spectrometry. This aldehyde was used for covalent bioconjugation with an aminooxy/alkyne-crosslinker. Linker-bound Env trimers (lnkr-Env) were then immobilized on the CaP surface via a Click reaction. Reporter assays based on fluorescent gel analysis and CLSM proved that the Env conjugation was highly aldehyde-specific and efficient. Most importantly, conformational ELISA and surface FACS analyses indicated that the pre-fusion conformation is preserved. oCaPs induced stronger B cell activation in vitroand higher Env-specific antibody levels in vivo than randomly coupled CaPs. Taken together, this study established a nanoparticle delivery platform for future immunomodulatory vaccine approaches and diagnostic applications in the context of various pathogens.

Alternate abstract:

Ein neuer Schwerpunkt der HIV Impfstoffforschung sind synthetische Nanopartikel, die mit optimierten Trimeren des Oberflächenproteins (Env) gekoppelt wurden. Der zusätzliche Einschluss von T-Helferzell-Epitopen aus humanen Impfstoffen in solche Nanopartikel macht es möglich, bestehende CD4+ T-Zellen zu rekrutieren, damit diese intrastrukturelle Hilfe (ISH) für Env-spezifische B-Zellen nach der Partikelimpfung leisten. In dieser Studie wurde die Eignung von T-Helfer-Calciumphosphat-Nanopartikeln (T-Helfer CaPs), die ein immunodominantes Tetanus-Toxoid-Epitop (p30) im Inneren und Env-Trimere auf der Oberfläche enthalten, funktionell und durch präklinische Immunisierungen untersucht. Verglichen mit löslichen Env-Trimeren konnten T-Helfer CaPs die Aktivierung Env-spezifischer, naiver B-Zellen in vitro induzieren. Immunisierungen mit T-Helfer CaPs führten zu signifikant erhöhten humoralen Immunantworten durch ISH in Mäusen, die zuvor mit einem lizensierten Tetanusimpfstoff immunisiert wurden. Die Env-Antikörperbildung in ISH-Mäusen war vergleichbar stark wie in Tieren, welche CpG-adjuvantierte CaPs erhielten. Im Gegensatz zu CpG wurden durch ISH keine Immunmechanismen induziert, die mit erhöhtem HIV-Infektionsrisiko in Verbindung gebracht werden. Infolge dieser vielversprechenden Ergebnisse wurde die Nanopartikelherstellung durch eine orthogonale Env-Kopplung optimiert (oCaPs). Dazu wurde ein Aldehyd-Tag (LCTPSR) an den C-Terminus eines Env-Proteins kloniert, das sich zu stabilen Trimeren zusammenlagert. Das Tag-interne Cystein wird nach der Translation in ein Formylglycin mit einer Aldehydgruppe konvertiert. Dies wurde mittels Massenspektrometrie bestätigt. Nach kovalenter Oxim-Ligation der Aldehydgruppe mit einem aminooxy/alkin-Linker, wurde Linker-gebundenes Env in Folge durch eine Click-Reaktion auf der Oberfläche von CaPs immobilisiert. SDS-PAGE-basierte Analysen und CLSM sowie konformationelle ELISAs und Oberflächen-FACS zeigten, dass der Vorgang spezifisch und effizient verläuft und die Env-Konformation erhalten bleibt. Verglichen mit unspezifisch gekoppelten CaPs, führten oCaPs zu besserer B-Zell-Aktivierung in vitround erhöhten Env-Antikörperspiegeln in vivo. Zusammenfassend zeigt diese Studie die Etablierung einer Nanopartikelplattform für zukünftige Impfstoffstudien und diagnostische Anwendungen mit Bezug auf verschiedenste pathogene Erreger.