L'activité de la NADPH oxydase: une nouvelle cible pour la curcumine?

Abstract

La NADPH oxydase (Nox2) des neutrophiles (PMNs) est une enzyme multi-protéique responsable de la production d'espèce activées de l'oxygène (ROS) pour la destruction des pathogènes. L'activation excessive des PMNs est souvent associée à des pathologies mortelles chez le cheval, faisant de l'activité de la Nox2 une cible thérapeutique privilégiée. Le premier but de ce travail, a été de développer une méthode appelée "cell-free system" (CSF) pour mesurer l'activité in vitro de la Nox2 équine. Un inconvénient de cette technique sont les interférences possibles entre les inhibiteurs et la sonde utilisée pour la mesure de l'activité. Sur base de notre CFS, nous avons créé l'EquiNox2, un nouvel outil pharmacologique, pour étudier les interactions entre des inhibiteurs et la Nox2 et leurs effets sur l'assemblage et l'activité de l'enzyme. Cette méthode consiste en la mesure in vitro de l'activité de la Nox2 fixée sur un support solide, ce qui permet d'éliminer les inhibiteurs avant la mesure de l'activité et réduit les interférences citées pour le CFS. Le CFS et l'EquiNox2 ont été validés avec le diphénylène iodonium et le Gp91ds-tat, deux inhibiteurs connus de la Nox2 humaine. Le deuxième but de ce travail, était l'étude du NDS27, un complexe de lysinate de curcumine avec l'hydroxypropyl-β-cyclodextrine (HPβCD) sur la réponse oxydante des PMNs. Le NDS27, n'est pas toxique et est capable d'entrer et d'interagir avec les membranes des PMNs et d'inhiber l'activité de la myéloperoxydase, la Nox2 et la PKCδ (un activateur de Nox2) impliquées dans la production de ROS. Nous avons montré en CFS et EquiNox2 que le NDS27 se fixe fortement à la Nox2 pour empêcher son assemblage et que l'HPβCD, l'excipient du NDS27, en plus de solubiliser et transporter la curcumine, augmente l'action de celle-ci sur les activités de la PKC et la Nox2. L'effet modulateur du NDS27 sur l'activation de la Nox2 ouvre des perspectives thérapeutiques pour traitement des pathologies accompagnées de réactions inflammatoires excessives.

Alternate abstract:

The NADPH oxidase (Nox2), a multi-component enzyme found in neutrophils (PMNs), generates reactive oxygen species (ROS) to kill pathogens. In horses, excessive activation of PMNs is often associated with deadly pathologies making the modulation of Nox2 activity a prime therapeutic target in the management of inflammation. The first aim of this work was to develop a method called cell-free system (CFS) to measure the in vitro activity of equine Nox2 and to test the effects of potential inhibitors on the enzyme activity or assembly. A major drawback of this technique lies in the potential interferences between inhibitors and the probe used to measure the activity. Based on our CFS, we designed a new pharmacological tool, the EquiNox2, to determine the direct interaction of potential inhibitors with equine Nox2 and their effect on the enzyme activity or assembly. This method consists in the in vitro measurement of Nox2 activity bound onto a solid support which allows for the elimination the inhibitors prior the measurement of activity, thus avoiding the risk of the interferences observed for the CFS. The CFS and EquiNox2 were validated using diphenyleneiodonium chloride and Gp91ds-tat, two inhibitors largely described for human Nox2. The second aim of this work was the study of NDS27, a complex of curcumin lysinate with hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD), on oxidant response of PMNs. NDS27, without affecting cell viability, was able to cross and interact with cell membranes to inhibit the activity of three enzymes involved in ROS production: myeloperoxidase, Nox2 and PKCδ, a Nox2 activator. We demonstrated by both CFS and EquiNox2 methods that NDS27 could strongly bind to Nox2 and prevents its assembly. We also showed that the excipient of NDS27, HPβCD, not only solubilised and transported curcumin, but also indirectly enhanced its action on both PKC and Nox2 activities. The modulatory effect of NDS27 on the Nox2 activation pathway of neutrophils may open potential therapeutic solutions for the treatment of pathologies with excessive inflammatory reactions.