Atividade antagonística in vitro de fungos endofíticos isolados de duas macrófitas aquáticas contra fitopatógenos

Abstract

Fitopatógenos são responsáveis por grandes prejuízos econômicos e por grandes perdas nas colheitas em culturas pelo mundo. microrganismos endofíticos são aqueles que vivem em tecidos vegetais, ocupando espaços inter ou intracelulares. Por ocupar nichos similares aos dos fitopatógenos, os microrganismos endofíticos podem ser considerados como controladores biológicos, conferindo ao hospedeiro proteção e resistência contra estes patógenos. Este trabalho teve como objetivos: a investigação da atividade antagonística in vitro, de fungos endofíticos isolados de Eichhornia azurea e Eichhornia crassipes, contra os fitopatógenos Colletotrichum sp. e Alternaria alternata. Os fungos endofíticos foram testados para atividade antagonística contra os fungos fitopatogênicos Colletotrichum sp. e Alternaria alternata. O teste de antagonismo in vitro foi avaliado estatisticamente por meio de análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott. Pode-se notar, no presente estudo, que os indivíduos com maior índice de antagonismo contra o fitopatógeno Colletotrichum sp., foram os endófitos AZ13 (Alternaria palandui - KF852593) com 70,87% e AZ26 (Bipolaris papendorfii KF852597) com 81,15% de IA. Contra o fitopatógeno Alternaria alternata, os endófitos que demonstraram os maiores índices de antagonismo foram o AZ26 (Bipolaris papendorfii - KF852597) e AZ33 (Pestalotiopsis sp - KF852598), com 49% e 57%. Estes resultados sugerem que estes fungos podem ser promissores para o uso no biocontrole destes fitopatógenos.

Alternate abstract:

Endophytic microorganisms are microorganisms that live in plant tissues and occupy intercellular or intracellular spaces. They can occur in the same niche as phytopathogens, so they can be considered biological controllers that confer host protection and resistance to phytopathogens. The aim of this study was to investigate the in vitro antagonistic activity against the phytopathogens Colletotrichum sp. and Alternaria alternata. The in vitro antagonism test was statistically evaluated by analysis of variance (ANOVA) and the mean values were compared with the Scott-Knott test. The endophytic isolates with the highest antagonism indices against the phytopathogen Colletotrichum sp. were AZ13 (Alternaria palandui - KF852593) with 70.87% and AZ26 (Bipolaris papendorfii - KF852597) with 81.15%. Against the phytopathogen Alternaria alternata, endophytes AZ26 (Bipolaris papendorfii - KF852597) and AZ33 (Pestalotiopsis sp. - KF852598) had the highest antagonism indices with 49 and 57 %, respectively. These results suggest that these fungi may be promising for biocontrol of these phytopathogens.

Headnote

RESUMO: Fitopatógenos são responsáveis por grandes prejuízos econômicos e por grandes perdas nas colheitas em culturas pelo mundo. microrganismos endofíticos são aqueles que vivem em tecidos vegetais, ocupando espaços inter ou intracelulares. Por ocupar nichos similares aos dos fitopatógenos, os microrganismos endofíticos podem ser considerados como controladores biológicos, conferindo ao hospedeiro proteção e resistência contra estes patógenos. Este trabalho teve como objetivos: a investigação da atividade antagonística in vitro, de fungos endofíticos isolados de Eichhornia azurea e Eichhornia crassipes, contra os fitopatógenos Colletotrichum sp. e Alternaria alternata. Os fungos endofíticos foram testados para atividade antagonística contra os fungos fitopatogênicos Colletotrichum sp. e Alternaria alternata. O teste de antagonismo in vitro foi avaliado estatisticamente por meio de análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott. Pode-se notar, no presente estudo, que os indivíduos com maior índice de antagonismo contra o fitopatógeno Colletotrichum sp., foram os endófitos AZ13 (Alternaria palandui - KF852593) com 70,87% e AZ26 (Bipolaris papendorfii KF852597) com 81,15% de IA. Contra o fitopatógeno Alternaria alternata, os endófitos que demonstraram os maiores índices de antagonismo foram o AZ26 (Bipolaris papendorfii - KF852597) e AZ33 (Pestalotiopsis sp - KF852598), com 49% e 57%. Estes resultados sugerem que estes fungos podem ser promissores para o uso no biocontrole destes fitopatógenos.

Palavras-chave: Endófitos; Plantas aquáticas; Biotecnologia.

ABSTRACT: Endophytic microorganisms are microorganisms that live in plant tissues and occupy intercellular or intracellular spaces. They can occur in the same niche as phytopathogens, so they can be considered biological controllers that confer host protection and resistance to phytopathogens. The aim of this study was to investigate the in vitro antagonistic activity against the phytopathogens Colletotrichum sp. and Alternaria alternata. The in vitro antagonism test was statistically evaluated by analysis of variance (ANOVA) and the mean values were compared with the Scott-Knott test. The endophytic isolates with the highest antagonism indices against the phytopathogen Colletotrichum sp. were AZ13 (Alternaria palandui - KF852593) with 70.87% and AZ26 (Bipolaris papendorfii - KF852597) with 81.15%. Against the phytopathogen Alternaria alternata, endophytes AZ26 (Bipolaris papendorfii - KF852597) and AZ33 (Pestalotiopsis sp. - KF852598) had the highest antagonism indices with 49 and 57 %, respectively. These results suggest that these fungi may be promising for biocontrol of these phytopathogens.

Keywords: Endophytes; Aquatic plants; Biotechnology

(ProQuest: ... denotes formula omitted.)

1 INTRODUÇÃO

As produções agrícolas são afetadas por fitopatógenos desde seu início e consequentemente ao longo da história humana, eles foram a causa de grandes perdas agrícolas e de até mesmo de grandes crises de fome pelo mundo inteiro. Atualmente perde-se bilhões de dólares por ano em decorrência das perdas por fitopatógenos (Mishra; Arora, 2017). O gênero Colletotrichum tem grande importância por possuir fitopatógenos causadores de patologias como podridão pós-colheita e antracnoses, sendo responsáveis por perdas em culturas pelo mundo (Bhunjun et al., 2021). Alternaria alternata é outro fitopatógeno notável para diversas culturas, causando porcentagem altas de perdas pré e pós-colheita, os principais sintomas causados são o apodrecimento, a ferrugem e manchas, que podem ocorrer em diversas partes da planta (Tozlu et al., 2018).

Macrófitas aquáticas são plantas que se caracterizam por possuírem partes vegetativas, com crescimento ativo permanente ou por um período, em ambiente aquático, seja ela submersa ou flutuante (Pott; Pott, 2000). A Eichhornia azurea (Kunth) é uma importante constituinte dos corpos d'água, pois podem servir de alimento para inúmeras espécies, e como habitat para diversos macroinvertebrados aquáticos, além de contribuir com o aumento de matéria orgânica nestes ambientes (Azevedo et al., 2008; Silva; Henry, 2013). A espécie Eichhornia crassipes (Mart) tem sido usada como agente fitorremediador, onde tem se mostrado eficiente na diminuição de metais pesados como As, Cd, Cu, Cr, Fe, Mn, Ni, Pb e Zn (Agunbiade; Olu-owolabi; Adebowale, 2009; Oliveira et al., 2012; Modenes et al., 2013).

Microrganismos endofíticos são fungos e bactérias que colonizam os tecidos sadios da planta, em algum tempo do seu ciclo de vida, sem lhe causar danos aparentes (Mendes; Azevedo, 2007). Esses microrganismos são de grande interesse biotecnológico devido a sua capacidade de produzir compostos biologicamente ativos como antibióticos e metabólitos secundários. Estes inibem o desenvolvimento de patógenos, enzimas extracelulares e substâncias com atividades antitumorais. São exemplos de tal aplicação o composto quimioterápico Taxol, utilizado no tratamento do câncer de mama e ovário (Wang et al., 2000; Costa Neto et al., 2002; Strobel; Daisy et al., 2003; Cuzzi et al., 2011; Orlandelli et al., 2012; BernardiWenzel et al., 2013; Almeida et al., 2018).

Além da produção de compostos bioativos, a colonização dos tecidos vegetais por fungos endofíticos traz à planta o benefício da resistência contra fitopatógenos. Por possuírem o mesmo nicho ecológico, um dos meios de controle de fitopatógenos por parte dos endófitos é a competição por recursos envolvendo a interação entre esses organismos (Polli et al., 2013).

Desta forma este trabalho teve como objetivos: a investigação da atividade antagonística in vitro, de fungos endofíticos isolados de Eichhornia azurea e Eichhornia crassipes, contra os fitopatógenos Colletotrichum sp. e Alternaria alternata.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 OBTENÇÃO DOS ISOLADOS ENDOFÍTICOS

Os endófitos foram isolados das plantas E. azurea e E. crassipes coletadas da planície de inundação do alto rio Paraná, na Universidade estadual de Maringá (UEM)/Base Avançada do Nupélia, no município de Porto Rico, Paraná, Brasil, e isolados pelo método de fragmentação e identificados molecularmente por Almeida et al., (2015).

2.2 OBTENÇÃO DOS FITOPATÓGENOS

Os fungos entomopatogênicos Colletotrichum sp. e Alternaria alternata foram gentilmente cedidos pelo Laboratório João Lúcio de Azevedo da Escola superior de agricultura "Luiz Queiroz" (ESALQ), Universidade de São Paulo (USP), Brasil.

2.3 ATIVIDADE ANTAGONÍSTICA IN VITRO DOS ENDÓFITOS ISOLADOS

Os fungos endofíticos isolados dos tecidos foliares foram testados para atividade antagonística por meio da técnica de cultura pareada (Campanile; Ruscelli; Luisi, 2007) modificada. Discos de 6 mm de colônias crescidas por sete dias dos isolados endofíticos e fitopatógeno foram inoculados em pólos opostos de placas de Petri contendo meio de cultura BDA, a 4 cm de distância. Os testes foram realizados em triplicata, bem como o controle negativo, com o fitopatógeno em um (C1) ou ambos os pólos das placas (C2). As placas foram incubadas em incubadora B.O.D a 28ºC por 7 dias. O índice de antagonismo (IA) de cada endófito foi calculado utilizando-se a fórmula:

... (1)

Na qual rm=raio da colônia para o antagonista, RM = média nas demais direções. As interações competitivas entre endófitos e patógenos foram analisadas segundo a escala de Badalyan (Badalyan; Garibyan; Innocenti, 2002).

2.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA

O teste de antagonismo in vitro foi avaliado estatisticamente por meio de análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Por ocupar nichos similares ao dos fitopatógenos, os microrganismos endofíticos podem ser considerados como controladores biológicos, conferindo ao hospedeiro proteção e resistência contra estes patógenos (Bacon et al., 2001; Arnold et al., 2003; Azevedo et al., 2000).

Desta forma, no presente estudo foram avaliados 23 fungos endofíticos isolados de E. azurea e E. crassipes usando a técnica de Cultura Pareada contra dois fitopatógenos (A. alternata e Colletotrichum sp.). Por meio da análise de variância (ANOVA) do Índice de Antagonismo (IA), foram verificadas diferenças estatisticamente significativas entre as linhagens endofíticas testadas contra os fitopatógenos.

Frente ao fitopatógeno Colletotrichum sp., os IA obtidos variaram entre 22,85% e 81,15% sendo gerado oito grupos estatísticos distintos (Tabela 1). Os endófitos C25 (Phoma sp. - Genbank - KF852585) e C26 (Bipolaris sorokiniana – Genbank - KF852586), foram os isolados que apresentaram ausência de antagonismo. C5 (Microsphaeropsis arundinis – Genbank KF852580) e AZ37 (Microsphaeropsis arundinis - Genbank - KF852600), apresentaram os menores IA, sendo 22,53% e 22,85% respectivamente. Os endófitos que apresentaram os maiores índices de antagonismo foram, C36 (Bipolaris sp.- Genbank - KF852587), com 68,08%, AZ13 (Alternaria palandui – Genbank - KF852593), com 70,87% e AZ26 (Bipolaris papendorfii-Genbank - KF852597) com 81,15% (Figura 1), os demais isolados apresentaram índices de antagonismo que variaram entre 24% e 59,30%.

Os testes de culturas pareadas realizados no presente estudo mostram que o isolado endofítico com maior índice de antagonismo contra os fitopatógenos Colletotrichum sp. e A. alternata foi o isolado AZ26 (Bipolaris papendorfii Genbank - KF852597), assim demonstrando um potencial para o biocontrole de fungos fitopatogênicos, uma vez que este isolado apresentou índices de inibição similares aos do gênero Trichoderma testado frente ao mesmo fitopatógeno por Begum , et al., (2008). Dentro da agricultura e da literatura científica, o gênero Trichoderma é muito conhecido por auxiliar na produção de plantações e principalmente por ser amplamente utilizado como agente de biocontrole contra fitopatógenos.

O biocontrole de fitopatógenos por parte dos fungos endofíticos envolve mecanismos que geralmente ocorrem simultaneamente para neutralizar o fungo patogênico. Dentre os mecanismos utilizados pelos endófitos podemos citar a antibiose, processo no qual o endófito produz enzimas e compostos orgânicos como alcalóides, ácidos, álcoois, entre outros, capazes de neutralizar o patógeno (Ownley; Gwinn; Vega, 2009).

O gênero Bipolaris ganhou destaque após a descrição de dois compostos bioativos com propriedades anti-proliferativas de células cancerosas (Kuan et al., 2015). Além da produção de compostos bioativos, os fungos do gênero Bipolaris já foram relacionados com a produção de enzimas envolvidas com a degradação da parede celular. Aich et al., (2017) analisaram o genoma do fungo Bipolaris sorokiniana, onde foram notados genes homólogos da família GH, GH3, GH6, GH7, GH45 e AA9, que codificam endonucleases responsáveis pela degradação de parede celular. Desta forma acredita-se que o isolado endofítico AZ26 (Bipolaris papendorfii - Genbank KF852597) pode ter utilizado a antibiose como um dos mecanismos para a inibição do fitopatógeno Colletotrichum sp.

Outro isolado endofítico com que apresentou um IA expressivo foi o AZ13 (Alternaria palandui – Genbank - KF852593). Fungos deste gênero apresentam uma ampla distribuição na natureza e hábitos de vida diversos, desde fitopatógenos até endófitos. Representa um gênero de grande interesse pois apresenta uma ampla diversidade de metabólitos de atividades variadas como, citotóxicas e fitotóxicas, antitumorais e antimicrobianas, sendo que algumas espécies isoladas com fungos endofíticos apresentaram atividade antifúngica (Lou et al., 2013).

Em relação ao fitopatógeno A. alternata, a análise demonstrou que os IA obtidos variaram entre 12,75% e 56,95%, sendo gerado sete grupos estatísticos distintos (Tabela 1). Os endófitos que demonstraram menores índices de antagonismo foram AZ12 (Cercospora sp. - KF852592) e C21 (Cercospora sp. - GenbankKF852592) com 12,8% e 20,12% respectivamente. Já os endófitos com maior índice de antagonismo foram AZ26 (Bipolaris papendorfii - KF852597) e AZ33 (Pestalotiopsis sp.- Genbank-KF852598) (Figura 2), com 48,85% e 57% respectivamente. Os demais isolados demonstraram índices entre 20,63% e 42,89%.

O gênero Pestalotiopsis é conhecido pelo grande interesse biotecnológico, suas espécies são geralmente isoladas como endófitos e são amplamente distribuídas pela região tropical. São produtoras de uma grande variedade de compostos bioativos com aplicações na indústria, dentro da medicina e na agricultura. Os metabólitos secundários produzidos por Pestalotiopsis spp. são diversos e com atividades variadas como antitumoral, antimicrobiano e até mesmo antifúngica (Maharachchikumbura et al., 2014), corroborando com os resultados obtidos neste estudo.

De acordo com a escala de Badalyan, as interações competitivas entre endófitos, tanto os isolados de E. azurea quanto de E. crassipes, frente aos fitopatógenos Colletotrichum sp. e A. alternata foram em maioria do tipo A (Tabela 2), que é caracterizado pela inibição por contato micelial entre o endófito e o fitopatógeno. Estes resultados estão de acordo com os apresentados por Orlandelli et al., (2015), com isolados endofíticos oriundos de Piper hispidum frente aos mesmos patógenos. Tais observações nos fornecem informações importantes para a seleção de endófitos com potencial de biocontrole de fungos fitopatogênicos, uma vez que mostram como estes microrganismos interagem entre si.

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Desta forma, fica evidente o potencial antagonista dos fungos endofíticos isolados de E. azurea e E. crassipes, mostrando que estes isolados podem ser promissores para o uso no biocontrole destes fitopatógenos. Porém, para que seja aplicado novas investigações devem ser feitas para melhor compreensão dos mecanismos utilizados por estes endófitos para tais potenciais.

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Autor correspondente: Tiago Tognolli de Almeida

E-mail: [email protected]

Recebido em: 01/08/2022

Aceito em: 29/01/2024

References

REFERÊNCIAS

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