Évaluation de l’impact de l’extrapolation de Bioréacteur sur la Physiologie de Yarrowia Lipolytica Pour la Production de Lipase

Abstract

Les travaux entrepris au cours de cette thèse visent à mettre en place une méthodologie globale d’extrapolation de bioréacteurs. Le procédé de production de lipase par Yarrowia lipolytica a été plus particulièrement investigué, compte tenu de la complexité du système biologique et des paramètres physico-chimiques mis en œuvre. En effet, ce procédé met en œuvre une levure dite non conventionnelle dans un réacteur multiphasique G-L-L comprenant un substrat hydrophobe (le méthyloléate étant utilisé comme source de carbone renouvelable). Du fait du caractère strictement aérobie de ce type de levure, le transfert d’oxygène est un paramètre critique pour ce procédé. Dans un premier temps, l’ensemble des paramètres physico-chimiques clés du procédé ont été investigués (c’est-à-dire la dispersion du méthyloléate, les fluctuations en oxygène dissous et en pH). Cette évaluation a été menée en se basant sur des paramètres physico-chimiques (mélange du réacteur, transfert d’oxygène,…), mais également sur base de paramètres biologiques (synthèse et excrétion de la lipase, activation du gène lip2,…). Cette première étude a démontré que le paramètre critique était la fluctuation de l’oxygène dissous, ce paramètre menant à une réduction du rendement spécifique en lipase, liée à une atténuation de l’activité du gène lip2 codant pour la lipase extracellulaire de Y. lipolytica. Ce paramètre est d’autant plus important que les amplitudes des fluctuations en oxygène dissous sont amplifiées lors du processus de montée en échelle pour l’extrapolation du procédé. L’efficacité de dispersion du substrat hydrophobe (méthyloléate) au sein du milieu aqueux ne semble pas avoir d’impact sur l’efficacité du procédé, la levure sécrétant un biosurfactant permettant de stabiliser la dispersion. Les fluctuations en pH ont également peu d’impact sur le rendement de production de lipase, mais des observations au microscope ont révélé un début de dimorphisme cellulaire. Cette observation démontre la complexité de la réponse du système biologique face aux conditions de procédé. L’impact des fluctuations en oxygène dissous sur l’activité du gène lip2 a été confirmé par des analyses plus poussées en PCR quantitative (RT-qPCR). La deuxième partie du travail a donc été focalisée sur l’optimisation du transfert d’oxygène. Cette optimisation n’est pas triviale si on considère le phénomène de formation de mousse important lorsque la dispersion G-L au sein du réacteur est trop fine. Deux stratégies antimousse ont donc été envisagées : l’une mettant en œuvre l’ajout d’antimousse chimique et l’autre l’emploi d’un briseur de mousse mécanique. Cette dernière méthode s’est révélée inefficace du fait de la formation d’une couche de mousse persistante entre la surface du liquide et la turbine du briseur de mousse. Des analyses en cytométrie en flux ont permis d’observer un phénomène de dimorphisme qui semble lié au passage des cellules microbiennes au travers de cette couche de mousse, ce qui diminue le rendement en lipase. L’ajout d’antimousse chimique a donc été retenu et le transfert d’oxygène a pu être optimisé en fonction de contraintes de formation de mousse en considérant un enrichissement progressif de l’air d’entrée en oxygène pur. La dernière partie du travail a consisté à estimer l’extrapolation du procédé en prenant en compte à la fois les contraintes physico-chimiques du système (optimisation du transfert d’oxygène et limitation de la formation de mousse), ainsi que les contraintes biologiques. Cette extrapolation a tout d’abord été estimée au niveau de réacteurs scale-downpermettant de reproduire les défauts d’écoulement généralement rencontrés au niveau industriel. De manière surprenante, cette étude a démontré que suite à l’adaptation physiologique des micro-organismes aux conditions d’écoulement, les problèmes de formation de mousse étaient de moins en moins marqués au cours de la montée en échelle du procédé. Cette observation va à l’encontre des calculs du génie chimique qui prédisent une augmentation du volume de mousse généré suite à la montée en volume des bioréacteurs et a été validée au niveau d’un bioréacteur pilote de 500L. Cela nous mène à conclure que la présence d’hétérogénéités au sein du volume réactionnel ne doit pas forcément être considérée comme un facteur négatif et pourrait au contraire être exploitée afin d’améliorer les performances des procédés et le design des bioréacteurs.

Alternate abstract:

The thesis involves the development of a global methodology for bioreactor scale-up. The process of lipase production by Yarrowia lipolytica has been particularly investigated since it involves most of the issues experienced in biochemical reactor engineering, i.e. oxygen transfer, substrate heterogeneities and foam formation. The complexity of biological system will be more toroughly investigated. Indeed, this process involves a non-conventional yeast in a gas-liquid-liquid multiphasic reactor including a hydrophobic substrate (methyloleate is used as a renewable carbon source). Generally, oxygen transfer is a critical parameter for this process owing to the fact that Y. lipolytica is a strict aerobe. First, all essential physico-chemical parameters of the process have been investigated i.e. the methyloleate dispersion, fluctuation of dissolved oxygen and pH fluctuation. This evaluation was conducted on the basis of biological parameters (syntheses and excretion of lipase, activation of gene lip2...) beside the physico-chemical parameters (reactor mixing, oxygen transfer...). Following this first screening phase, dissolved oxygen fluctuation has been identified as the critical parameter. This parameter did not lead just to reduction in specific lipase yield, but also reduction in the activity of the gene encoding the lipase extracellular (lip2) of Y. Lipolytica. This parameter has a special importance since dissolved oxygen fluctuations are amplified during the scaling up of the process in bioreactor. The influence of hydrophobic substrate dispersion efficiency (méthyloléate) in the aqueous medium was minimized due to the bio-surfactant secretion of yeast which stabilizes the dispersion. The pH fluctuation has also a limited impact on the performance of lipase production, but microscopic observation revealed an early cellular dimorphism. This observation demonstrates the complex response of biological system which was exposed to process-related perturbations. The impact of dissolved oxygen fluctuations on the activity of the lip2gene was confirmed by further analysis using quantitative PCR (RT-qPCR). The second part of this work has been focused on the oxygen transfer optimisation, but the main issue identified during this phase was foam formation. Indeed, gas-liquid dispersion within the reactor leads to strong forming issues, especially with the presence of foam stabilisers as the extracellular protein (lipase). Chemical (chemical antifoam addition) and mechanical (mechanical foam breaker) foam control strategies have been investigated in order to evaluate the optimization of the oxygen transfer in function of the foam formation. The mechanical method was proved ineffective because of the formation of a persistent foam layer between the liquid surface and the foam breaker turbine. Flow cytometry analysis have revealed a phenomenon of dimorphism. This phenomenon seems to be associated with the passage of microbial cells through the foam layer where cells are exposed to unsuitable condition causing reduction in the lipase yield. In fact, reduction of the overall oxygen transfer efficiency of the system is inevitable in order to keep antifoam consumption at a reasonable level. A regulation strategy involving oxygen enrichment of the air flow through the reactor has to partly overcome this issue. The last part of the work has been based on the estimation of the impact of the scale-up process by taking into account both the physical and chemical constraints of the system (optimization of oxygen transfer and limiting the formation of foam) and the biological constraints. This scaling-up procedure was firstly estimated in scale-down reactor to reproduce flow defects encountered at the industrial scale. Surprisingly, this study showed that the foaming issues were attenuated in scale-down reactors because of the adaptation of physiological microorganisms to flow conditions. This observation was not consistent with chemical engineering calculations that predict an increase in the volume of foam generated by scaling-up bioreactors. This result has been validated in a 500L pilot bioreactor. Consequently, the presence of heterogeneities in the working volume should not necessarily be considered as a negative factor and could be exploited to improve the performance and the design of bioreactors.