Positional Identification of a Regulatory Mutation in the Porcine IGF2 Gene Influencing Muscle Mass & Fat Deposition

Abstract

Recent advances in genomics now allow for the identification of the genes and mutations that underlie the heritability of agronomically important traits in livestock. The corresponding genes are said to map to Quantitative Trait Loci (QTL), and the mutations referred to as Quantitative Trait Nucleotides (QTN). The most commonly used approach relies on positional cloning which typically proceeds in three steps: QTL mapping by linkage analysis, QTL fine-mapping by linkage disequilibrium or association analysis, and QTN identification combining haplotype analysis and functional assays. Knowledge of QTL and QTN provides insights into the genetic architecture of complex traits and physiology of production traits, and opens novel possibilities for enhanced selection referred to as Marker Assisted Selection (MAS).

This thesis is devoted to QTN identification of a QTL that was previously mapped to pig chromosome 2 and fine-mapped to a 250 Kb segment encompassing the imprinted IGF2 gene. The QTL was shown to have a major post-natal effect on muscle mass and fat deposition, and to be subject to parental imprinting as only the padumnal chromosome affects the phenotype.To identify the QTN we have first generated 32 Kb and 56 Kb of finished porcine sequence encompassing the IGF2 and H19genes, respectively. The corresponding sequences were annotated including definition of gene models, identification of interspersed repeats and determination of 97 sequence elements that are highly conserved between pig, human and mouse.

We have then resequenced 28 Kb encompassing the IGF2 gene for 15 boar chromosomes for which the QTL genotype had been determined by progeny-testing or Marker Assisted Segregation Analysis (MASA). This revealed 258 polymorphisms of which only one (Int3-3072G>A) cosegregated perfectly with QTL genotype. The corresponding single nucleotide polymorphism (SNP) is a G to A transition affecting one of the highly conserved sequence elements located just downstream of differentially methylated region 1 in intron 3. We have demonstrated that the Int3-3072 A allele associated with increased muscle mass is also associated with increased IGF2 mRNA levels in post-natal striated muscle (but not in pre-natal muscle nor in pre- and post-natal liver). However, the Int3-3072G>A SNP does not alter imprinting nor allele-specific methylation. Using a luciferase reporter assay, we then demonstrated that the Int3-3072 A allele reduces the cis activity of a silencer element, and using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA), that it abrogates binding of a nuclear factor assumed to be a trans-acting silencing factor. Taken together both genetic and functional evidence strongly support the conclusion that the Int3-3072G>A SNP is the causative SNP.

The thesis is concluded by a discussion that (i) highlights the factors that make domestic animals a unique resource for the molecular dissection of complex phenotypes, (ii) comments the Asian origin of the Int3-3072A allele associated with increased muscle mass, (iii) describes recent advances in characterizing the trans-acting silencing factor binding to the Int3-3072G allele, (iv) pinpoints statistical issues related to the detection of imprinted QTL, (v) reports on the utility of the Int3-3072G>A SNP for MAS applied to pig breeding, and (vi) makes projections on how latest progress in genome analysis will affect positional identification of QTN in the near future.

Alternate abstract:

Grâce aux progrès récents en génomique, il est maintenant possible d’identifier les gènes et mutations qui sous-tendent l’héritabilité des caractères de production chez les animaux de rente. Ces gènes se localisent au niveau de Loci de Traits Quantitatifs (QTL), et les mutations correspondantes sont qualifiées de Nucléotides de Traits Quantitatifs (QTN). La démarche expérimentale la plus couramment utilisée est le clonage positionnel. Celui-ci comprend trois étapes: cartographie de QTL par analyses de liaison génétique, cartographie fine de QTL par études d’association exploitant le déséquilibre de liaison, et identification de QTN par combinaison d’analyses haplotypiques et fonctionnelles. L’identification de QTL et QTN non seulement révèle l’architecture génétique des phénotypes complexes que sont les caractères de production, ainsi que les rouages moléculaires qui les sous-tendent, mais ouvre également des possibilités nouvelles de sélection plus performante dite Assistée par Marqueurs (MAS).

Cette thèse est consacrée à l’identification d’un QTN correspondant à un QTL d’abord localisé sur le chromosome 2 du porc, et ensuite cartographié finement dans un segment chromosomique de 250 Kb comprenant le gène IGF2. Le QTL en question a un effet post-natal majeur sur la croissance musculaire et le dépôt graisseux. Il est soumis à l’empreinte parentale, l’allèle paternel étant le seul à influencer le phénotype. Afin d’identifier le QTN, nous avons tout d’abord généré 32 Kb et 56 Kb de séquences finies, comprenant respectivement les gènes IGF2 et H19. Les séquences correspondantes ont été annotées bioinformatiquement, y compris la définition de modèles gèniques, l’identification de séquences répétées dispersées, ainsi que de 97 éléments de séquence fortement conservés chez le porc, l’homme et la souris.

Nous avons ensuite re-séquencé 28 Kb chevauchant le gène IGF2 pour 15 chromosomes dont le génotype au niveau du QTL fut préalablement déterminé par testage de descendance ou Ségrégation Assistée par Marqueurs. Cet exercice a révélé 258 polymorphismes dont un seulement (Int3-3072G>A) correspondait parfaitement aux génotypes QTL. Ce polymorphisme est une transition G à A affectant un des 97 éléments hautement conservés, situé juste en aval de la région différentiellement méthylée (DMR1) dans l’intron 3. Nous avons ensuite démontré que l’allèle Int3-3072 A, associé à une augmentation de la masse musculaire, est également associé à une augmentation des taux d’ARNm IGF2 dans le muscle strié post-natal (mais non dans le muscle strié pré-natal, ni dans le foie pré- et post-natal). Par contre, le polymorphisme Int3-3072G>A n’affecte ni état d’empreinte ni de méthylation allèle-spécifique du gène. Nous avons ensuite démontré à l’aide d’un test rapporteur de type luciférase que l’allèle Int3-3072 A réduit l’activité d’un élément silenceur agissant en cis,et à l’aide d’un test de type EMSA qu’il empêche la liaison d’un facteur nucléaire. Conjointement, ces données génétiques et fonctionnelles démontrent que le polymorphisme Int3-3072G>A SNP correspond bien au QTN.

Nous concluons la thèse par une discussion dans laquelle nous (i) démontrons pourquoi les animaux domestiques offrent des possibilités uniques pour la dissection moléculaire de phénotypes complexes, (ii) commentons l’origine asiatique de l’allèle Int3-3072A associé à une augmentation du développement musculaire, (iii) décrivons les progrès récent dans l’identification du facteur nucléaire reconnaissant spécifiquement l’allèle Int3-3072G, (iv) attirons l’attention sur les artéfacts statistiques associés à la détection de QTL soumis à l’empreinte, et (v) discutons l’impact de nouvelles technologies génomiques sur le clonage positionnel de gènes.