Producción Biológica y Caracterización Estructural de Pigmentos Indigoides de Interés Industrial

Abstract

Los indigoides son pigmentos naturales obtenidos a partir de plantas y animales. En las civilizaciones mediterráneas, estos pigmentos fueron utilizados como colorantes, mientras que las culturas asiáticas los usaron en el tratamiento de enfermedades. En la era moderna, la atención de los fabricantes europeos fue capturada por el uso masivo de índigo para teñir ropa en China e India. Esto llevó a sustituir la extracción de fuentes naturales por la síntesis química en pleno auge de la química industrial. Estas investigaciones y trabajos de finales del siglo XIX permitieron identificar y desarrollar rutas sintéticas para obtenerlos a partir de derivados del petróleo como la anilina. Sin embargo, estos procesos requieren una gran cantidad de energía y de solventes, ácidos y agentes alcalinos.

En los últimos años, la ingeniería enzimática y el desarrollo de bacterias como biocatalizadores surgen como una alternativa verde prometedora para evitar el uso de estos materiales peligrosos y, en consecuencia, prevenir la generación de desechos tóxicos. En esta investigación, describimos dos nuevas variantes de una enzima fenilacetona monooxigenasa (PAMO) mediante mutagénesis de saturación iterativa, llamadas PAMO_HPCDy PAMOHPED, para las cuales se descubrió, por casualidad, que su expresión heteróloga en E. coliproduce indigoides. Asimismo, caracterizamos la estabilidad térmica y cinética enzimática de estas variantes, y cuantificamos la producción en célula entera de índigo e indirrubina, los indigoides principales de interés industrial, mediante HPLC. Los mayores rendimientos se obtuvieron utilizando la variante PAMO_HPCDsuplementando el medio de cultivo con L-triptófano, produciendo hasta ~3000 mg L ^-1de índigo y ~130,0 mg L ^-1de indirrubina. Además, ambas enzimas oxidan el indol y derivados de éste, produciendo índigo e indigoides sustituidos, siendo PAMO_HPCDcapaz de producir el conocido pigmento púrpura de Tiro (6,6'-dibromoíndigo). De este modo, PAMO_HPCDy PAMOHPED tienen una aplicación potencial en las industrias textil, farmacéutica y de semiconductores, impulsando el uso de estrategias amigables con el medio ambiente para obtener una diversidad de indigoides.

Alternate abstract:

Indigoids are natural pigments obtained from plants and animals by ancient cultures. In Mediterranean cultures BC. was used mainly as dyes, whereas Asian cultures also applied these compounds as treatment agents for several diseases. In the modern era, the attention of European manufacturers was captured by the massive use of indigo to dyes clothes in China and India. This led to replace the extraction from natural sources by chemical synthesis in full swing of the industrial chemistry. These researches and works by the late 1800s have made possible to identify and develop synthetic routes to obtain them from petroleum derivatives such as aniline. However, these processes required high amount of energy and large amounts of solvents, acids, and alkali agents.

In the recent years, enzyme engineering and the development of bacteria as biocatalysts emerges as a promising green alternative to avoid the use of these hazardous materials and consequently prevent toxic waste generation. In this research, we describe two novel variants of the enzyme phenylacetone monooxygenase (PAMO) made by iterative saturation mutagenesis, called PAMO_HPCD and PAMO_HPED, which were serendipitously found to produce indigoids upon heterologous expression in E. coli. We characterized the thermal stability and enzyme kinetics of these new variants, and we evaluated indigo and indirubin production in a whole-cell system by HPLC. The highest yields were obtained with PAMO_HPCD supplemented with L-tryptophan, producing ~3000 mg L^-1 indigo and ~130.0 mg L^-1 indirubin. Additionally, both enzymes oxidize indole and derivatives, producing indigo and substituted indigoids, with PAMO_HPCD being able to produce the well-known Tyrian purple (6,6’-dibromoindigo). Our results indicate that PAMO_HPCD and PAMO_HPED have potential application in the textile, pharmaceutics, and semiconductors industries, prompting the use of environmentally friendly strategies to obtain a diverse variety of indigoids.