Caracterización bioquímica y funcional de una nueva serina/treonina quinasa putativa (AKT-like) de Trypanosoma cruzi

Las proteínas quinasas son dianas farmacológicas prometedoras debido a su papel esencial en las vías de señalización celular. En este trabajo, proponemos la identificación y validación funcional de una proteína asociada a la vía de señalización PI3K/AKT/mTOR, una posible segunda proteína de tipo serina/treonina quinasa В (AKT2-like) de Trypanosoma cruzi, como potencial diana farmacológica para el tratamiento de la enfermedad de Chagas. La proteína AKT2-like fue expresada en Escherichia coli, se purifico mediante cromatografía de afinidad, intercambio iónico y exclusión por tamaño. La actividad quinasa se evaluó mediante un ensayo inmunoenzimático en fase sólida. Se obtuvieron anticuerpos para la AKT2-like en conejo, y mediante Western-blot se detectó la proteína endógena en epimastigotes de Т. cruzi. Para la búsqueda de inhibidores específicos de la AKT2-like se empleó una aproximación in silico mediante docking molecular y la base de datos de medicamentos de segundos usos reframeDB (https://reframedb.org/). El modelo 3D de la proteína AKT2-like fue generado por AlphaFold y trRosetta, la base de datos reframeDB se preparó para el docking utilizando los softwares ADFR y OpenBabel. La selección de los mejores ligandos (Medicamentos) se basó en el puntaje de AutoDock Vina. En conclusión, se purificó la proteína recombinante AKT2-like, se determinó su actividad quinasa y se inmunodetectó la proteína en extractos de epimastigotes de 7. cruzi. En el modelo 3D de la AKT-2-like presentó estabilidad en los dominios PH, AGC y quinasa, el dominio N-terminal FY VE fluctúo alrededor de la hélice alfa que conecta los dominios FY VE y PH. Sin embargo, la parte C-terminal conserva su estructura secundaria y la proteína presento una desviación estándar cuadrada (RMSD) estable. Con base en los resultados del puntaje de AutoDock Vina, se evaluaron in vivo 5 medicamentos de segundo uso, de los cuales un medicamento (T6269) presento una CL50 de 23.32+ 0.37 ug/ml en células U937 y una CE50 de 10.04+ 1.76 ug/ml para amastigotes de T. cruzi. Los resultados in silico y experimentales nos permitieron validar la, existencia de una segunda serina/treonina quinasa B-like en 7. cruzi y su posible uso como blanco para el tratamiento de la enfermedad de Chagas.

Financiado: CODI- convocatoria programática 2019-2020: Ciencias de la Salud. Acta (2020-33254), Universidad de Antioquia

Palabras clave: AKT/PKB, compuestos de segundo uso, enfermedad de Chagas, quinasa, Trypanosoma cruzi