"COMPLETE CLOSED CIRCULAR CHROMOSOMES" - A NEW STEP IN THE GENETIC ANALYSIS OF MICROORGANISMS

Abstract

Objectives. This study validates a high-throughput workflow using Oxford Nanopore Technology (ONT) to generate complete, closed circular microbial chromosomes and plasmids. We demonstrate its superior resolution for genomic epidemiology over traditional, fragmentedread methods like Multi-Locus Sequence Typing (MLST), Single Nucleotide Polymorphism (SNP) analysis, and core/whole-genome MLST (cg/wgMLST). Materials and methods. We performed hybrid ONT long-read and Illumina short-read sequencing on 50 clinical isolates and a public reference set (n = 90). Genomes were assembled and circularized using an autocycler and polished with Medaka. We assessed genome relatedness and typing resolution using sourmash, pling, and the novel k-mer tool lexicmap, benchmarking them against traditional in-silico MLST, SNP, and cg/wgMLST analyses. Results and discussion. The hybrid workflow consistently generated complete circular chromosomes, plasmids, and phages. lexicmap demonstrated significantly higher discriminatory power than traditional typing, resolving transmission clusters missed by cgMLST. Complete genome structures revealed the precise location of resistance genes and mobile elements, uncovering complex structural variations (e.g., inversions, transpositions, duplications) invisible to SNP-based methods. This unambiguous view of genome architecture is critical for understanding pathogen evolution, outbreak dynamics, and genetic mobilization. Conclusions. Integrating ONT sequencing with novel bioinformatic tools represents a paradigm shift, moving beyond fragmented SNP or gene-based comparisons to a holistic, structureaware understanding of the genome. Generating complete closed circular chromosomes is now a feasible, high-throughput reality, offering unprecedented resolution for clinical diagnostics, genomic surveillance, and evolutionary studies. Funding source: This work was carried out through the "Nucleu" Program within the National Research, Development and Innovation Plan 2022-2027, with the support of the Ministry of Research, Innovation and Digitalization (MCID), project no. 23 44.

Alternate abstract:

Obiective. Acest studiu validează un flux de lucru cu utilizând tehnologia Oxford Nanopore (ONT) pentru a genera cromozomi și plasmide microbiene circulare complete. Demonstrăm rezoluția superioară pentru epidemiologia genomică față de metodele de secvențiere de a 2-a generație, cu citiri scurte, cum ar fiMulti-Locus Sequence Typing (MLST), analiza polimorfismului nucleotid (SNP) și core genome/whole genome MLST (cg/wgMLST). Materiale și metode. Am efectuat secvențiere hibridă ONT cu citire lungă și secvențiere Illumina cu citire scurtă pe 50 de izolate clinice și un set de referință public (n = 90). Genomurile au fost asamblate și circularizate folosind autocycler și lustruite (polished) cu medaka. Am evaluat Înrudirea genomului și rezoluția tipizării folosind sourmash, pling și noul instrument k-mer lexicmap, comparându-le cu analizele tradiționale MLST, SNP și cg/wgMLST. Rezultate și discuții. Fluxul de lucru ONT a generat În mod constant cromozomi, plasmide și fagi circulari compleți. Lexicmap a demonstrat o putere discriminatorie semnificativ mai mare decât tipizarea tradițională, ofering informații despre clusterele de transmisie ce nu sunt vizibile de cgMLST. Structurile complete ale genomului au dezvăluit locația precisă a genelor de rezistență și a elementelor mobile, oferind informații asupra variantelor structurale complexe (de exemplu, inversiuni, transpoziții, duplicări) ce nu pot fidecelate prin metodele bazate pe SNP-uri. Această viziune lipsită de ambiguitate asupra arhitecturii genomului este esențială pentru Înțelegerea evoluției agenților patogeni, a dinamicii focarelor și a mobilizării genetice. Concluzii. Integrarea secvențierii ONT cu instrumente bioinformatice noi reprezintă o schimbare de paradigmă, depășind SNP-urile fragmentate sau comparațiile bazate pe gene către o Înțelegere holistică, conștientă de structură, a genomului. Generarea de cromozomi circulari Închiși completi este acum o realitate fezabilă, cu randament ridicat, oferind o rezoluție fără precedent pentru diagnosticarea clinică, supravegherea genomică și studiile evolutive. Sursa de finanțare: Această lucrare a fost realizată prin Programul „Nucleu" din cadrul Planului Național de Cercetare, Dezvoltare și Inovare 2022-2027, cu sprijinul Ministerului Cercetării, Inovării și Digitalizării (MCID), proiectul nr. 23 44.