Hitzeschockproteine Bei Der Pathogenese Des Systemischen Lupus Erythematodes

Abstract

Bei Patienten, die an der Autoimmunerkrankung systemischer Lupus erythematodes leiden, werden apoptotische Zellen von Phagozyten oftmals unzureichend internalisiert, so daß sterbende Zellen sekundär nekrotisch werden. Dadurch werden zum Teil modifizierte intrazelluläre Bestandteile freigesetzt, was die Generierung von Autoantikörpern begünstigt, die hauptsächlich gegen nukleäre Moleküle wie Histone, Nukleosomen und dsDNA gerichtet sind. Die Beobachtung, daß apoptotische Zellen neben klassischen „Eat-me“-Signalen wie Phosphatidylserin (PS) unter anderem auch Histone und Nukleosomen auf der Außenseite ihrer Plasmamembran exponieren und entsprechende Hinweise aus der Literatur ließen einen spezifischen Oberflächenrezeptor auf Makrophagen vermuten, der Histone bzw. Nukleosomen erkennt. Ein Defekt dieses putativen Rezeptors könnte möglicherweise an der beeinträchtigen Phagozytose apoptotischer Zellen beim SLE beteiligt sein. Deshalb war ein Ziel dieser Arbeit einen membranständigen Bindungspartner für Histone auf Makrophagen zu identifizieren und mögliche Bindemotive für Histone auf apoptotischen Zellen zu ermitteln, da bislang keine Oberflächenstrukturen bekannt sind, die für eine Exposition von Histonen während der Apoptose verantwortlich sind.

Mit Hilfe von immobilisierten Phospholipiden konnte in vorliegender Studie die Bindung von Histonen an PS aufgedeckt werden, zusätzlich wurde die Interaktion der verschiedenen Histonklassen mit PS-haltigen Liposomen quantifiziert, wobei die Affinität für H2A am stärksten war. Während der Apoptose könnten deshalb Histone bereits im Kern mit nukleärem PS einen Komplex eingehen, der dann an die Oberfläche apoptotischer Zellen transloziert wird und durch Membranintegration von PS zur Exposition der Histone führt.

Die Existenz eines potentiellen Histonrezeptors auf Makrophagen wurde an Membranpräparationen einer murinen Makrophagenzellinie durch Pull-down mit Histon-Sepharose untersucht. Dabei wurden mehrere Mitglieder der Familie der Hitzeschockproteine wie Grp94, Calreticulin, Hsp70, FKBP12 und BiP zusammen mit Histonen präzipitiert. Obwohl Grp94, Calreticulin sowie BiP typischerweise im ER und Hsp70 bzw. FKBP12 im Zytoplasma lokalisiert sind, ist das Vorkommen dieser Hsps nicht auf diese Kompartimente limitiert. Die Membranlokalisation von Calreticulin, BiP und Hsp70 wurde in der murinen Zellinie RAW264.7 durch verschiedene Methoden bestätigt, zudem wurden Calreticulin und BiP als Bestandteile spezialisierter Membrandomänen, den sogenannten Lipid Rafts, in verschiedenen Immunzellinien identifiziert. Darüber hinaus war auch Hsp90 maßgeblich in Lipid Rafts dieser Zellen exprimiert. Mittels Oberflächenplasmonresonanz und Fluoreszenztitration wurden Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (KD) von 4 nM bzw. 440 nM berechnet, die eine starke Wechselwirkung zwischen Hsp90 und Histonen widerspiegeln. Funktionell könnte diese Interaktion bei der Phagozytose von Bedeutung sein, da Hsp90 in vitro die Aufnahme FITC-konjugierter Sepharose in Anwesenheit verschiedener Serumbedingungen beeinflußte. Aus der Interaktion von Hsp90 mit Histonen bzw. Nukleosomen und der Histonbindung an PS entstand das Modell eines ternären Komplexes, der beim SLE zu einer gesteigerten Immunogenität dieser Moleküle führen könnte.

Ein weiterer Zusammenhang der Hsps mit SLE könnte sich aus genetischer Sicht erschließen, da die Gene für Hsp90, FKBP51 und Hsp70 auf Chromosom 6 in einem Suszeptibilitätslokus für humanen SLE angesiedelt sind. Deshalb wurde in dieser Arbeit die genetische Assoziation verschiedener alleler Varianten dieser drei Hsps mit SLE in einer Fall-Kontroll-Studie zu analysieren. Bei einer Erlanger Kohorte wurden ein SNP im Bereich von Hsp90 (P=0,0258) und ein Haplotyp (CACTG) des Hsp70-Lokus (P=0,0086) identifiziert, die jeweils signifikant mit SLE assoziiert waren. Die Assoziation der allelen Variante TG des Hsp70-Genbereichs konnte zudem in einer unabhängigen Replikationsstudie mit noch höherer statistischer Signifikanz (P=0,31 x 10^-5) bestätigt werden.

Alternate abstract:

In patients suffering from the autoimmune disease systemic Lupus erythematosus apoptotic cells are often insufficiently internalised by macrophages, thus dying cells enter stages of secondary necrosis. Hence, partially altered intracellular components are released, promoting the generation of autoantibodies, which are mainly directed against nuclear antigens such as histones, nucleosomes and dsDNA. The observation that apoptotic cells expose not only classical „eat me“ signals such as phosphatidylserine (PS) but also histones and nucleosomes on the outer surface of their plasma membrane supported earlier speculations about a surface receptor on macrophages with histone / nucleosome recognition capacity. A malfunction of these putative receptors could possibly be involved in defective clearance mechanisms of apoptotic cells in patients with SLE. Therefore, the first goal of this work was to identify a binding partner of histones in the plasma membrane of macrophages and to discover binding motifs for histones on apoptotic cells, because no surface structures are known to date, that are responsible for the exposure of histones during the process of apoptosis.

The concept that histones could reach the outer membrane of apoptotic cells by interaction with PS originated from the observation that PS can be found in relatively high amounts in the nuclear matrix, and from older studies, which provided first evidence for an interaction between nuclear PS and chromatin. In this study binding of histones to PS was analysed using immobilised phospholipids and the interaction of different histone classes with PS-containing liposomes was calculated with H2A showing the strongest affinity. Hence, histones could complex with nuclear PS during apoptosis, thereby translocating to the surface of apoptotic cells and exposing histones as a result of integration of PS into the outer leaflet of the plasma membrane. In pull-down experiments using histones covalently coupled to sepharose, the existence of a potential receptor for histones on macrophages was investigated in a murine macrophage cell line. Several members of the heatshock protein family such as Grp94, Calreticulin, Hsp70, FKBP12 and BiP were precipitated with histones. Even though Grp94, Calreticulin as well as BiP are typically ER resident, whereas Hsp70 and FKBP12 can be found in the cytoplasm, none of these proteins is restricted to these compartments. The localisation of Calreticulin, BiP and Hsp70 in membranes of RAW264.7 cells was confirmed by different methods. Additionally, Calreticulin and BiP were identified as components of specialised membrane domains termed as lipid rafts in various immune cell lines. Furthermore, Hsp90 was also expressed in lipid rafts of these cells in relatively high amounts. The binding capacity of Hsp90 to histones was quantified by SPR and fluorescence titration and the calculated equilibrium binding constants (KD) of 4 nM and 440 nM, respectively, describe a strong interaction between histones and Hsp90. These interactions could be relevant during apoptosis, because Hsp90 affected the phagocytosis of FITC-conjugated histones in vitro depending on different serum conditions. The interaction of Hsp90 and histones / nucleosomes together with the binding of histones to PS led to the model of a ternary complex, which might also enhance the immunogenicity of these molecules, a fact which might be relevant for the immunopathogenesis of SLE.