Destruction of Strongyloides venezuelensis infective larvae by fungi Duddingtonia flagrans, Arthrobotrys robusta and Monacrosporium sinense

Abstract

INTRODUCTION: Strongyloides venezuelensis has been used as a model for studying human strongyloidosis. METHODS: This study aimed to compare the ability of predatory nematophagous fungi Duddingtonia flagrans (AC001), Arthrobotrys robusta (I-31) and Monacrosporium sinense (SF53) and on infective larvae (L3) of Strongyloides venezuelensis in laboratory conditions on 2% water-agar medium. RESULTS: At the end of the experiment, the percentage reductions of Strongyloides venezuelensi L3 were: 93% (AC001), 77.2% (I-31) and 65.2% (SF53). CONCLUSIONS: The nematophagous fungi were able to capture and destroy the L3 in vitro and can be used as biological controllers of Strongyloides venezuelensi.

COMUNICAÇÃO COMMUNICATION

Destruição de larvas infectantes de Strongyloides venezuelensis pelos fungos Duddingtonia flagrans, Arthrobotrys robusta e Monacrosporium sinense

Destruction of Strongyloides venezuelensis infective larvae by fungi Duddingtonia flagrans, Arthrobotrys robusta and Monacrosporium sinense

Fabio Ribeiro BragaI; Juliana Milani AraujoI; André Ricardo e SilvaI; Jackson Victor de AraújoI; Rogério Oliva CarvalhoI; Alexandre de Oliveira TavelaI; Manoel Eduardo da SilvaI; Fernanda Mara FernandesI; Alan Lane de MeloII

IDepartamento de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG

IIDepartamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG

Endereço para correspondência

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RESUMO

INTRODUÇÃO: Strongyloides venezuelensis tem sido utilizado como um modelo para estudo da estrongiloidose humana.

MÉTODOS: O objetivo deste trabalho foi comparar a capacidade predatória dos fungos nematófagos Duddingtonia flagrans (AC001), Arthrobotrys robusta (I-31) e Monacrosporium sinense (SF53) sobre larvas infectantes (L3) de Strongyloides venezuelensis em condições laboratoriais no meio ágar-água 2%.

RESULTADOS: Ao final do experimento, os percentuais de redução de L3 de Strongyloides venezuelensis observados foram de: 93% (AC001); 77,2% (I-31) e 65,2% (SF53).

CONCLUSÕES: Os fungos nematófagos foram capazes de capturar e destruir in vitro as L3, podendo ser utilizados como controladores biológicos de Strongyloides venezuelensis.

Palavras-chaves: Fungos nematófagos. Strongyloides venezuelensis. Controle biológico.

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ABSTRACT

INTRODUCTION: Strongyloides venezuelensis has been used as a model for studying human strongyloidosis.

METHODS: This study aimed to compare the ability of predatory nematophagous fungi Duddingtonia flagrans (AC001), Arthrobotrys robusta (I-31) and Monacrosporium sinense (SF53) and on infective larvae (L3) of Strongyloides venezuelensis in laboratory conditions on 2% water-agar medium.

RESULTS: At the end of the experiment, the percentage reductions of Strongyloides venezuelensi L3 were: 93% (AC001), 77.2% (I-31) and 65.2% (SF53).

CONCLUSIONS: The nematophagous fungi were able to capture and destroy the L3 in vitro and can be used as biological controllers of Strongyloides venezuelensi.

Keywords: Nematophagous fungi. Strongyloides venezuelensis. Biological control.

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Entre os nematoides, parasitas intestinais de grande impacto na saúde pública e animal, estão os do gênero Strongyloides1. O nematoide Strongyloides stercoralis é o causador da estrongiloidose humana, importante problema médico e social que atinge até 100 milhões de pessoas em cerca de 70 países, sendo a maioria desses localizados em regiões tropicais e subtropicais da Ásia, África e America Latina2. O Strongyloides venezuelensis possui ciclo pulmonar infectando roedores e possui uma rota de migração pela via clássica através da corrente sanguínea aos pulmões e para o intestino delgado, semelhante ao de Strongyloides stercoralis em humanos. O desenvolvimento de Strongyloides stercoralis e Strongyloides venezuelensis ocorre no ambiente (ciclo de vida livre) e no hospedeiro (ciclo de vida parasitária). A fase parasitária inicia-se com a penetração das larvas filarióides (L3) através da mucosa e da pele, e chegam ao intestino delgado onde atingem a maturidade. O parasita é eliminado através das fezes do hospedeiro na forma de ovos e/ou larvas rabditóides. Essa via de infecção é similar a vários geo-helmintos que infectam o homem, tais como Ancylostoma duodenale e Necator americanus3 . Pesquisas demonstram que Strongyloides venezuelensis tem sido utilizado para padronizar novas técnicas imunológicas, com a finalidade de se aperfeiçoar o diagnóstico da estrongiloidose humana4.

A estrongiloidose é uma infecção causada pelo contato do indivíduo com as L3 presentes no ambiente, podendo ser facilmente evitada pelo tratamento adequado do material fecal. Segundo Paulino e cols5, tal processo constitui um dos problemas sanitários de maior importância. Sendo assim, medidas alternativas de controle são importantes e, dentre elas, estão o uso de fungos nematófagos presentes no meio ambiente, como uma alternativa viável e cuja ação está concentrada no ambiente fecal e direcionada ao combate dos ovos, e o uso das larvas infectantes dos geo-helmintos6.

Diversos antagonistas naturais de nematoides, entre eles, bactérias, vírus, protozoários, besouros, ácaros e fungos, são descritos como controladores biológicos em potencial7. Contudo, os fungos nematófagos têm apresentado resultados promissores no combate aos geo-helmintos presentes no ambiente contaminado. As espécies de fungos nematófagos Duddingtonia flagrans, Arthrobotrys robusta e Monacrosporium sinense são identificadas como predadoras e têm sido estudadas como agentes controladores biológicos de nematoides potencialmente zoonóticos, entretanto, podem existir diferenças no mecanismo de ação desses fungos sobre os distintos gêneros de nematoides8, por isso a necessidade de mais estudos.

O objetivo deste trabalho foi comparar a capacidade predatória in vitro, dos fungos das espécies Duddingtonia flagrans, Arthrobotrys robusta e Monacrosporium sinense sobre larvas infectantes de Strongyloides venezuelensis.

Foram utilizados três isolados de fungos nematófagos, um de Duddingtonia flagrans (AC001), um de Arthrobotrys robusta (I31) e um de Monacrosporium sinense (SF53). Esses isolados são oriundos de solo do Brasil, na localidade de Viçosa na zona da mata de Minas Gerais, e são provenientes do Laboratório de Parasitologia da Universidade Federal de Viçosa. Os fungos foram mantidos em tubos de ensaio a 4ºC, contendo corn-meal-ágar 2% e no escuro durante 10 dias. Após o crescimento dos isolados, novos discos de cultura de 4mm de diâmetro foram transferidos para placas de Petri de 9,0cm de diâmetro contendo 20mL de agar-água 2% (AA 2%) onde foram acrescidos de 1mL de água destilada contendo 1.000 larvas de Panagrellus sp, nematoide de vida livre, diariamente durante um período de 21 dias para indução da formação de conídios fúngicos. Quando se observou o completo desenvolvimento fúngico, 5mL de água destilada foram adicionados a cada placa de Petri, sendo que os conídios e fragmentos miceliais foram removidos segundo a técnica descrita por Araújo e cols9.

Coproculturas realizadas com fezes de camundongos da linhagem AKR/J experimentalmente infectados com Strongyloides venezuelensis foram colocadas em aparelho de Baermann modificado para a recuperação das L310. A linhagem de Strongyloides venezuelensis utilizada neste estudo vem sendo mantida em camundongos AKR/J, com passagens sucessivas desde 1987 em condições laboratoriais11. A seguir, realizou-se o teste de predação em superfície de placas de Petri de 9cm de diâmetro preenchidas com AA 2% de acordo com técnica modificada por Mota e cols12. Foram formados quatro grupos, três grupos tratados com os fungos e um grupo controle (sem fungos). Nas placas de Petri, foram vertidos 0,1mL de solução contendo 5 x 103 conídios por ml (500 conídios) de cada fungo AC001, I-31, SF53 e 500L3 de Strongyloides venezuelensis em cada grupo tratado. As placas do grupo controle receberam apenas 500L3 de Strongyloides venezuelensis na superfície das placas de Petri. Foram realizadas seis repetições para cada grupo. Durante sete dias, a cada 24h, 10 campos aleatórios de 4mm de diâmetro em cada placa dos grupos tratados e controle foram observados em microscópio óptico em objetiva de 10x, contando-se o número de L3 não predadas. Ao final de sete dias, foram recuperadas as L3não predadas do conteúdo das placas de Petri através do aparelho de Baermanncom água a42ºC.A média de L3de Strongyloides venezuelensis recuperadas foi calculada. Os dados foram interpretados estatisticamente pela análise de variância em níveis de significância de 5% de probabilidade.

A eficiência de predação de L3 em relação ao controle foi avaliada pelo teste de Tukey ao nível de 1% de probabilidade. Posteriormente, o percentual de redução da média de L3 foi calculado de acordo com seguinte equação:

No presente ensaio in vitro, os isolados dos fungos predadores de nematóides testados, Duddingtonia flagrans (AC001), Arthrobotrys robusta (I-31) e Monacrosporium sinense (SF53) foram capazes de predar as L3 de Strongyloides venezuelensis. Comparando a captura e destruição de L3 de Strongyloides venezuelensis nas placas de Petri dos grupos tratados com os isolados AC001, I-31 e SF53, durante sete dias a cada 24h foi observado que não houve diferença (p > 0,05), conforme descrito na Tabela 1. Diferença (p < 0,05) foi observada entre as médias de L3 de Strongyloides venezuelensis não predadas por campo de 4mm de diâmetro das placas do grupo controle em relação as médias de L3 registradas nas placas dos grupos tratados com fungos durante todo o experimento.

Foram observados os seguintes percentuais de redução de L3 de S. venezuelensis: 93% (AC001); 77,2% (I-31) e 65,2% (SF53). A presença das L3 de Strongyloides venezuelensis nas placas de Petri contendo AA2% foi essencial para a formação das armadilhas pelos isolados fúngicos, uma vez que, esse meio de cultura é pobre em nutrientes (Figuras 1A e B). Nas placas do grupo controle, apenas foram observadas a presença de L3 de Strongyloides venezuelensis.

A comprovação da predação foi verificada pelas médias de L3 de Strongyloides venezuelensis recuperadas por meio do método de Baermann no sétimo dia ao final do experimento (Figura 2).

Fungos nematófagos possuem capacidade de destruir as L3 de geo-helmintos, com destaque para as espécies Duddingtonia flagrans, Arthrobotrys robusta e Monacrosporium sinense8 . Todavia, a capacidade predatória dessas espécies nunca tinha sido testada sobre L3 de Strongyloides venezuelensis. Além disso, poucos trabalhos têm mencionado a atividade predatória in vitro de diferentes fungos nematófagos sobre larvas de nematóides do gênero Strongyloides, constituindo a necessidade de maiores pesquisas. Em relação a sua nutrição, esses fungos não são exigentes. Segundo Eren e Pramer13, o fornecimento periódico de nematoides aos fungos em meio de cultura pobre em nutrientes, reduziria o seu crescimento saprófita. Dessa forma, no presente trabalho foi utilizado o meio AA 2%, meio pobre em nutrientes, com a intenção de reduzir o crescimento saprófita dos isolados fúngicos utilizando apenas as L3 de Strongyloides venezuelensis como fonte de nutrição. Por outro lado, quanto maior a mobilidade dos nematoides, maior o estímulo ao fungo para a produção de armadilhas. No presente estudo, este fato foi observado, uma vez que, a formação de armadilhas e predação das L3 pelos isolados fúngicos foram visualizadas logo na primeira observação, ocorrido após 24h de interação.

Em trabalho recente, Braga e cols8 registraram que em meio de cultura AA 2% o fungo Duddingtonia flagrans demonstrou maior atividade predatória (80,3%) sobre L1 de Angiostrongylus vasorum em relação aos demais isolados utilizados, Monacrosporium thaumasium (74,5%) e Arthrobotrys robusta (71,8%). Estes resultados estão de acordo com o presente trabalho, uma vez que a maior atividade predatória in vitro observada ao final do experimento sobre L3 de Strongyloides venezuelensis foi para o isolado fúngico de Duddingtonia flagrans (AC001) em meio AA 2%. No entanto, faz-se necessário a realização de mais pesquisas que possam demonstrar a interação destes e de outros fungos nematófagos sobre L3 de nematoides gastrintestinais ajudando na sua diminuição ambiental e, por conseguinte nas infecções.

Concluiu-se que os fungos Duddingtonia flagrans (AC001), Arthrobotrys robusta (I-31) e Monacrosporium sinense (SF53) têm atividade predatória sobre larvas infectantes Strongyloides venezuelensis e, possivelmente, constituem uma alternativa de controle biológico das L3 desse nematoide.

CONFLITO DE INTERESSE

Os autores declaram não haver nenhum tipo de conflito de interesse no desenvolvimento do estudo.

SUPORTE FINANCEIRO

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

REFERÊNCIAS

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8. Braga FR, Carvalho RO, Araujo JM, Silva AR, Araújo JV, Lima WS, et al. Predatory activity of the fungi Duddingtonia flagrans, Monacrosporium thaumasium, Monacrosporium sinense and Arthrobotrys robusta on Angiostrongylus vasorum first-stage larvae. J Helminthol 2009;83:303-308. [ Links ]

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10. Barçante JMP, Barçante TA, Dias SRC, Vieira LQ, Lima WS, Negrão-Corrêa D. A method to obtain axenic Angiostrongylus vasorum first-stage larvae from dog feces. Parasitol Res 2003;89:89-93. [ Links ]

11. Melo AL, Martins WA, Bicalho RS. The AKR/J mouse as a laboratory host for maintenance of cycle of Strongyloides ratti. In: International Congress of Laboratory Animal Science. Águas de Lindóia: Col Bras Experimentação. Resumos; 1990. p.72. [ Links ]

12. Mota MA, Campos AK, Araújo JV. Avaliação da capacidade predatória dos fungos Arthrobotrys robusta e Monacrosporium thaumasium sobre nematóides gastrintestinais parasitos de bovinos, submetidos a diferentes métodos de preservação. Rev Bras Parasitol Vet 2002;11:13-17. [ Links ]

13. Eren J, Pramer D. The most probable number of nematode-trapping fungi in soil. Soil Sci 1965;99:285. [ Links ]

Endereço para correspondência:

Dr. Fabio Ribeiro Braga

Deptº de Veterinária/UFV

Av. Ph Rolfes s/n, 36570-000 Viçosa, MG

Tel: [phone]

e-mail: [email protected]

Recebido para publicação em 25/06/2010

Aceito em 04/08/2010