Molecular diagnosing of malaria in a tertiary care center in the Brazilian Amazon region

Abstract

The routine test for diagnosing malaria is still the thick blood smear, despite its known decreased sensitivity and specificity in situations of low parasite density and mixed infections. The polymerase chain reaction is increasingly being used for molecular detection and identification of Plasmodium species, due to its higher sensitivity and specificity. Nested PCR was performed on whole-blood samples from 344 patients with acute febrile syndrome who came to a tertiary healthcare center in Manaus (State of Amazonas) for diagnostic confirmation of malaria. No malaria cases caused by Plasmodium malariae were detected through the blood smear or PCR. Co-positivity of 96.7%, co-negativity of 62.2% and kappa coefficient of 0.44 were observed between PCR and thick blood smear for Plasmodium falciparum. For Plasmodium vivax, co-positivity of 100%, co-negativity of 78.1% and kappa coefficient of 0.56 were observed. For mixed infection, co-positivity of 100%, co-negativity of 84.9% and kappa coefficient of 0.26 were observed. Polymerase chain reaction detected a high number of mixed infections in the samples analyzed, but its routine use for diagnosing malaria still deserves further discussion.

Diagnóstico molecular da malária em uma unidade de atenção terciária na Amazônia Brasileira

Molecular diagnosing of malaria in a tertiary care center in the Brazilian Amazon region

Mônica Regina Farias CostaI, II; Pedro Paulo Ribeiro VieiraI, II; Cynthia de Oliveira FerreiraIII; Marcus Vinícius Guimarães de LacerdaI, II, IV; Wilson Duarte AlecrimI, IV; Maria das Graças Costa AlecrimI, II, IV

IGerência de Malária. Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, Manaus, AM

IIUniversidade do Estado do Amazonas, Manaus, AM

IVUniversidade Federal do Amazonas, Manaus, AM

IVCentro Universitário Nilton Lins, Manaus, AM

Endereço para correspondência

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RESUMO

O exame de rotina para o diagnóstico da malária continua sendo a gota espessa, apesar da comprovada diminuição da sensibilidade e especificidade em situações de densidade parasitária baixa e infecções mistas. A reação em cadeia da polimerase vem sendo cada vez mais utilizada para a detecção molecular e identificação das espécies de plasmódio, por apresentar maior sensibilidade e especificidade. Foi realizada a nested-PCR em amostras de sangue total de 344 pacientes com síndrome febril aguda que se apresentaram para o diagnóstico de malária, em uma unidade terciária de saúde, em Manaus (Amazonas). Nenhum caso de malária por Plasmodium malariae foi diagnosticado à gota espessa ou PCR. Observou-se co-positividade de 96,7%, co-negatividade de 62,2% e coeficiente kappa de 0,44 entre PCR e gota espessa para Plasmodium falciparum. Para Plasmodium vivax, co-positividade de 100%, co-negatividade de 78,1% e coeficiente kappa de 0,56. Na detecção da malária mista, co-positividade de 100%, co-negatividade de 84,9% e coeficiente kappa de 0,26. A reação em cadeia da polimerase detectou alto número de infecções mistas nas amostras analisadas, mas seu uso rotineiro no diagnóstico da malária merece ainda ampla discussão.

Palavras-chaves: Malária. Diagnóstico. Biologia molecular. Reação em cadeia da polimerase.

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ABSTRACT

The routine test for diagnosing malaria is still the thick blood smear, despite its known decreased sensitivity and specificity in situations of low parasite density and mixed infections. The polymerase chain reaction is increasingly being used for molecular detection and identification of Plasmodium species, due to its higher sensitivity and specificity. Nested PCR was performed on whole-blood samples from 344 patients with acute febrile syndrome who came to a tertiary healthcare center in Manaus (State of Amazonas) for diagnostic confirmation of malaria. No malaria cases caused by Plasmodium malariae were detected through the blood smear or PCR. Co-positivity of 96.7%, co-negativity of 62.2% and kappa coefficient of 0.44 were observed between PCR and thick blood smear for Plasmodium falciparum. For Plasmodium vivax, co-positivity of 100%, co-negativity of 78.1% and kappa coefficient of 0.56 were observed. For mixed infection, co-positivity of 100%, co-negativity of 84.9% and kappa coefficient of 0.26 were observed. Polymerase chain reaction detected a high number of mixed infections in the samples analyzed, but its routine use for diagnosing malaria still deserves further discussion..

Key-words: Malaria. Diagnosis. Molecular biology. Polymerase chain reaction.

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O diagnóstico laboratorial rotineiro da malária é realizado pelo método da gota espessa, consistindo na identificação dos parasitos no sangue periférico, por meio de microscopia óptica. O aperfeiçoamento da microscopia e a introdução de corantes biológicos que permitem identificar a espécie, estádio de desenvolvimento, viabilidade e quantificação dos parasitos, tornaram o método simples, rápido e satisfatório quanto à sua sensibilidae e especificidade16. Entretanto, discute-se a baixa sensibilidade da técnica para o diagnóstico de baixas parasitemias (comum em portadores assintomáticos de plasmódio) e de infecções mistas13. Desde 1990, vários estudos têm ressaltado a aplicação da reação em cadeia da polimerase (polymerase-chain reaction ? PCR) no diagnóstico molecular da malária12 26, nos inquéritos epidemiológicos28 30, no rastreamento de doadores infectados em bancos de sangue27, na determinação do portador assintomático de plasmódio1 29 e no monitoramento da resposta terapêutica5. Mas apesar das inúmeras experiências demonstrarem que a PCR apresenta maior sensibilidade que o exame microscópico2 4 18 24 25 31 32, sendo até utilizado com padrão-ouro no diagnóstico da infecção, por alguns autores20, o real desempenho da técnica em campo carece de mais evidências, em especial pelo alto custo e infra-estrutura sofisticada ainda necessários para sua execução. Pela escassez de dados referentes ao desempenho da PCR em áreas endêmicas para malária, no Brasil, este trabalho teve a finalidade de analisar a experiência com o diagnóstico molecular da malária de uma unidade de atenção terciária para doenças infecciosas, em área hiper-endêmica para malária, na Amazônia Brasileira, comparando uma das mais reconhecidas técnicas de detecção de DNA genômico plasmodial com o tradicional diagnóstico pela gota espessa recomendado pela Organização Mundial da Saúde, tendo como objetivos secundários a estimativa da freqüência de infecções mistas e da infecção por Plasmodium malariae.

PACIENTES E MÉTODOS

Trata-se de um estudo de avaliação da co-positividade e da co-negatividade da PCR com a gota espessa, na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMT-AM), em Manaus (Amazonas). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FMT-AM (processo nº 2816/2002) e contou com o consentimento por escrito dos participantes.

Seleção dos pacientes. Foram selecionados aleatoriamente 344 pacientes com síndrome febril aguda, que procuraram a FMT-AM para o diagnóstico de malária, no período de janeiro de 2001 a dezembro de 2002.

Gota espessa. Na FMT-AM, o diagnóstico de rotina da malária é realizado pelo exame da gota espessa (método de Walker), seguindo a padronização da Organização Mundial de Saúde e do Ministério da Saúde do Brasil16. O diagnóstico da espécie e a quantificação da parasitemia foram realizados por dois técnicos com reconhecida experiência no diagnóstico microscópico de malária, através da contagem do número de parasitas, em campos de grande aumento, por 100 leucócitos. A seguir, a densidade parasitária era convertida para mm3 de sangue, utilizando a leucometria de cada paciente, obtida a partir de hemograma automatizado.

Extração do DNA. O DNA genômico plasmodial foi extraído de amostras de sangue total, coletadas destes pacientes. Para a extração do DNA parasitário, foi utilizado o Kit QIAamp DNA Blood Mini Kit® (QIAGEN® Cat. n° 51106), seguindo as especificações do fabricante e o método que emprega o Chelex®. O DNA genômico plasmodial foi armazenado em -20º C até a realização da PCR.

Amplificação do DNA. A PCR foi realizada conforme técnica utilizada na FMT-AM, desde 1999, com amplificação de uma região específica do DNA, utilizando-se iniciadores (primers) pré-desenhados e descritos por Snounou e cols25, objetivando a amplificação de regiões do gene codificante para a subunidade menor do RNA ribossomal do Plasmodium (ssurRNA). O método consiste em uma PCR aninhada (nested-PCR), com primers gênero-específicos na reação primária, e espécie-específicos na reação secundária (Tabela 1). As amplificações foram realizadas em termociclador Eppendorf®-Master Cycler Gradient, com total de 30 ciclos, com as seguintes temperaturas: desnaturação: 95°C/5?; anelamento: 55°C/2?; e extensão: 72°C/2?.

Análise de amplicons. Após a amplificação, o produto da PCR foi aplicado em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídeo (10µg/µL), e submetido à eletroforese com tampão TEB 1x. A observação dos segmentos de DNA amplificados foi feita em transiluminador, sob luz ultravioleta, e registrado em sistema digital para documentação de gel.

Análise dos resultados. Foram calculadas a co-positividade (equivalente à sensibilidade) e a co-negatividade (equivalente à especificidade) entre os testes, além da avaliação da concordância, pelo coeficiente kappa. A diferença entre médias de densidade parasitária foi estimada pelo teste não-paramétrico de Mann-Whitney.

RESULTADOS

A positividade global para infecção malárica à gota espessa foi 35,7%. Pela PCR, esta positividade foi 68,3%. Os resultados de gota espessa e PCR estão discriminados na Tabela 2. A ocorrência de infecção mista (Plasmodium falciparum + Plasmodium vivax) foi 1,1% (4/344) pela gota espessa e 14,8% (51/344) pela PCR. Na Figura 1A, observa-se um campo de grande aumento (1.000x) de gota espessa de paciente com malária mista, evidenciada pela presença de gametócitos de Plasmodium falciparum e trofozoítos amebóides (formas irregulares) de Plasmodium vivax. Em outra amostra, cuja gota espessa foi positiva apenas para Plasmodium vivax, o gel de eletroforese da PCR (Figura 1B) confirmou o diagnóstico de infecção mista (colunas 4 e 5). A PCR, portanto, detectou 13,4 vezes mais casos de infecção mista, em comparação com a gota espessa. Nenhum caso de malária por Plasmodium malariae foi diagnosticado pela gota espessa ou pela PCR. Comparando gota espessa e PCR na detecção de Plasmodium falciparum, observou-se co-positividade de 96,7%, co-negatividade de 62,2% e coeficiente kappa de 0,44. Para Plasmodium vivax, co-positividade de 100%, co-negatividade de 78,1% e coeficiente kappa de 0,56. Na detecção da malária mista, co-positividade de 100%, co-negatividade de 84,9% e coeficiente kappa de 0,26.

Nos casos em que a PCR detectou infecção mista, quando o paciente apresentava gota espessa positiva apenas para Plasmodium vivax, a média da parasitemia (à gota espessa) foi semelhante à média dos casos com infecção exclusiva por Plasmodium vivax, à PCR (3.555 parasitas/mm3 x 3.881 parasitas/mm3; teste de Mann-Whitney, p=0,23).

DISCUSSÃO

A gota espessa é um método sensível capaz de detectar 0,001% de parasitemia, ou seja, acima de 1 parasita/µL de sangue31. Contudo, o método torna-se pouco sensível quando os parasitas estão presentes em número muito reduzido (< 1/µL de sangue) ou quando o indivíduo está infectado por mais de uma espécie de plasmódio. Inúmeros estudos têm relatado a maior sensibilidade da PCR na detecção de baixas parasitemias3 4 19.

Sabe-se que a ocorrência de infecções por mais de uma espécie de plasmódio pode ser ainda maior14. Estudos realizados com PCR na Tailândia26, Venezuela17 e Brasil5 demonstraram a ocorrência de infecção mista em proporções acima das evidenciadas à gota espessa.

Estudo realizado na Venezuela demonstrou que 29% das infecções diagnosticadas à gota espessa como Plasmodium vivax, quando analisadas pela PCR, foram identificadas como infecções mistas por Plasmodium vivax e Plasmodium falciparum17. No Irã, estudo recente também demonstrou alta freqüência de infecções mistas não-identificadas à gota espessa7. Aproximadamente um terço das amostras positivas para Plasmodium vivax, à gota espessa, na nossa casuística, foram positivas para ambas espécies (Plasmodium falciparum/Plasmodium vivax) à PCR. A validade externa dos resultados encontrados, entretanto, é baixa, pois a freqüência de infecções mistas depende em grande parte das condições epidemiológicas de cada área endêmica e da época em que o estudo foi realizado.

A FMT-AM é uma das unidades de diagnóstico de malária de Manaus, tendo notificado em média 35% dos casos de malária do município, nos últimos 10 anos. Em 2003, a instituição registrou 30.017 casos de malária, sendo 125 (0,41%) de infecção mista. Se utilizarmos a PCR como padrão-ouro para o diagnóstico da infecção mista, de acordo com os resultados apresentados neste estudo, estimar-se-ia uma freqüência de infecção mista de 5,3% neste centro da Amazônia Ocidental Brasileira. Considerando que os resultados apresentados são oriundos de uma unidade de referência para o diagnóstico da malária no Estado do Amazonas, é possível que a quantidade de infecções mistas seja ainda mais sub-notificada na rede descentralizada de diagnóstico.

É necessário, entretanto, questionar se os parasitas detectados pela PCR são da fato implicados no quadro clínico agudo do paciente. Em função dos estudos que demonstram ocorrência de até 49,5% de portadores assintomáticos de plasmódio em Rondônia1, existe a possibilidade de que estes portadores crônicos de uma espécie se infectem por outra espécie responsável pelos sintomas clínicos, já que não há proteção clínica cruzada conferida por espécies diferentes. Observou-se também em Rondônia seis vezes mais casos de infecção mista à PCR, em relação à gota espessa, tendo sido esta freqüência menor em outra localidade com menos portadores assintomáticos de plasmódio1.

A PCR detectou 10% de infecções causadas pelo Plasmodium malariae, não identificadas pela microscopia, também em Rondônia, o que foi diferente de nossos resultados5. A ocorrência da infecção por esta espécie, em Mato Grosso, chegou a 11,9%, por PCR22. É possível que a distribuição desta espécie não seja homogênea em toda a Amazônia Brasileira.

A evidência de que amostras com infecção mista à PCR não apresentaram maior densidade parasitária em comparação às amostras com monoinfecção reforça a idéia de que nem sempre as gotas espessas positivas para Plasmodium vivax, com alta parasitemia devem ser interpretadas sistematicamente como lâminas de infecção mista, como orientado no passado aos microscopistas de áreas endêmicas.

A padronização de um protocolo único de PCR é um primeiro passo na tentativa de se avaliar o desempenho desta ferramenta da biologia molecular para o diagnóstico da malária, permitindo a comparação dos resultados obtidos em diferentes áreas endêmicas.

A realização da técnica com amostra de sangue total ou com amostra de sangue total em papel de filtro parece não interferir de maneira importante nos resultados, sendo que os trabalhos de campo, em geral, se beneficiam da coleta da amostra em papel de filtro, pela simplicidade de armazenamento e transporte até o laboratório onde o exame será realizado23.

Mais recentemente, a técnica de PCR em tempo real mostrou poder contribuir não apenas para diminuir as chances de contaminação das amostras, mas também para diminuir os custos e o tempo para a obtenção dos resultados9.

A alta co-positividade da PCR com a gota espessa na detecção de infecção malárica reforça sua utilidade em estudos epidemiológicos de prevalência, estudos de eficácia terapêutica e vacinal, detecção de portadores assintomáticos de plasmódio e na avaliação de novos métodos diagnósticos para malária10 15 21. Em bancos de sangue, o emprego da PCR pode ser de suma importância para o controle da malária transfusional8. Finalmente, o uso da PCR em unidades de referência pode ter alguma utilidade na avaliação do desempenho de microscopistas considerados experientes6.

A busca de novas alternativas diagnósticas para a malária é uma das metas do Programa Nacional de Controle da Malária (PNCM) do Ministério da Saúde, mas é preciso cautela ao escolher a PCR como teste padrão-ouro na comparação com outros testes diagnósticos da doença clínica, já que amplificando DNA, a PCR pode diagnosticar, p. ex., a presença apenas de formas sexuadas (gametócitos), não se prestando, portanto, para o diagnóstico exclusivo das formas consideradas patogênicas.

Os resultados apresentados sugerem que as infecções mistas na Amazônia Brasileira podem estar subestimadas e que a PCR pode ser uma importante ferramenta de diagnóstico da infecção pelo plasmódio, especialmente em condições nas quais a gota espessa apresenta pior desempenho. Não foram identificadas infecções por Plasmodium malariae nesta amostra estudada, em Manaus.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais e Infecciosas da Universidade do Estado do Amazonas, aos técnicos da Gerência de Malária da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, especialmente ao Sr. José Eckner Lessa, Sr. Jubal Gonzaga Simões, pela revisão das gotas espessas, e à Sra. Raimunda Ericilda Soares de Araújo, pela coleta de amostras e extração de DNA.

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Endereço para correspondência:

Dr. Pedro Paulo Ribeiro Vieira

Gerência de Malária/FMT-AM

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Recebido para publicação em 14/05/2007

Aceito em 02/07/2008

Órgãos financiadores: Superintendência da Zona Franca de Manaus (convênio nº 035/2002) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (convênio n° 550260/2001-3).