Predatory activity of the nematophagous fungi Duddingtonia flagrans, Monacrosporium thaumasium and Arthrobotrys robusta on Strongyloides stercoralis infective larvae

Abstract

INTRODUCTION: Strongyloides stercoralis is a nematode that infects much of the population worldwide. METHODS: This study aimed to compare the ability of predatory nematophagous fungi Duddingtonia flagrans (AC001), Monacrosporium thaumasium (NF34) and Arthrobotrys robusta (I-31) on infective larvae (L3) of Strongyloides stercoralis in laboratory conditions on 2% water-agar. RESULTS: At the end of the experiment, the percentage reductions in Strongyloides stercoralis L3 were 83.7% (AC001), 75.5% (NF34) and 73.2% (I-31). CONCLUSIONS: The nematophagous fungi were able to capture and destroy the L3 in vitro and may be used as biological controls of Strongyloides stercoralis.

COMUNICAÇÃO COMMUNICATION

Atividade predatória dos fungos nematófagos Duddingtonia flagrans, Monacrosporium thaumasium e Artrobotrys robusta sobre larvas infectantes de Strongyloides stercoralis

Predatory activity of the nematophagous fungi Duddingtonia flagrans, Monacrosporium thaumasium and Arthrobotrys robusta on Strongyloides stercoralis infective larvae

Fabio Ribeiro Braga; André Ricardo e Silva; Juliana Milani Araújo; Rogério Oliva Carvalho; Jackson Victor de Araújo; Luiza Neme Frassy

Departamento de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG

Endereço para correspondência

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RESUMO

INTRODUÇÃO: Strongyloides stercoralis é um nematoide que infecta grande parte da população mundial.

MÉTODOS: O objetivo deste trabalho foi comparar a capacidade predatória dos fungos nematófagos Duddingtonia flagrans (AC001), Monacrosporium thaumasium (NF34) e Arthrobotrys robusta (I-31) sobre larvas infectantes (L3) de Strongyloides stercoralis em condições laboratoriais no meio ágar-água 2%.

RESULTADOS: Ao final do experimento, os percentuais de redução de L3 de Strongyloides stercoralis observados foram de: 83,7% (AC001); 75,5% (NF34) e 73,2% (I-31).

CONCLUSÕES: Os fungos nematófagos foram capazes de capturar e destruir in vitro as L3, podendo ser utilizados como controladores biológicos de Strongyloides stercoralis.

Palavras-chaves: Fungos nematófagos. Strongyloides stercoralis. Controle biológico.

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ABSTRACT

INTRODUCTION: Strongyloides stercoralis is a nematode that infects much of the population worldwide.

METHODS: This study aimed to compare the ability of predatory nematophagous fungi Duddingtonia flagrans (AC001), Monacrosporium thaumasium (NF34) and Arthrobotrys robusta (I-31) on infective larvae (L3) of Strongyloides stercoralis in laboratory conditions on 2% water-agar.

RESULTS: At the end of the experiment, the percentage reductions in Strongyloides stercoralis L3 were 83.7% (AC001), 75.5% (NF34) and 73.2% (I-31).

CONCLUSIONS: The nematophagous fungi were able to capture and destroy the L3 in vitro and may be used as biological controls of Strongyloides stercoralis.

Key-words: Nematophagous fungi. Strongyloides stercoralis. Biological control.

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Estima-se que mais de 1 bilhão de pessoas no mundo são infectadas por geohelmintos através do solo, sugerindo, portanto que a contaminação ambiental é um importante indicador de risco da população humana de contrair estas infecções1. Por outro lado, os estudos sobre parasitismo em animais de estimação vêm despertando crescente interesse, frente à associação restrita e íntima entre o homem e os animais e sua consequência em saúde pública2.

O Strongyloides stercoralis é um nematoide do gênero Strongyloides, de elevada prevalência em todo o mundo. A doença, estrongiloidíase, produzida por esse verme é uma das mais importantes helmintoses intestinais em países tropicais, sendo o homem, seu principal reservatório, e a principal fonte de infecção3. Contudo, nos cães sua prevalência também é alta4. Além disso, o parasita do cão é morfologicamente e biologicamente indistinguível do humano5.

A infecção por Strongyloides stercoralis ocorre pela penetração das larvas infectantes (L3) através da pele humana intacta ou animal ou por ingestão acidental destas larvas. As larvas rabditoides eliminadas nas fezes do indivíduo parasitado podem seguir dois ciclos: direto (partenogenético) e o indireto (sexuado) ou de vida livre. Ambos, entretanto, darão origem a larvas filaróides infectantes. Após a oviposição, os ovos, já no solo e em condições favoráveis de temperatura e umidade, tornam-se embrionados; em seguida, eclodem, pondo em liberdade as larvas rabditóides (L1 e L2). As fases dos ciclos que se passam no solo exigem certas condições, tais como: solo arenoso, umidade alta, temperatura entre 25ºC e 30ºC e ausência de luz solar direta5.

A estrongiloidíase, como as demais helmintoses gastrintestinais, sendo doença devida à poluição do solo com fezes contaminadas, pode ser facilmente evitada pelo tratamento adequado do material fecal. No entanto, segundo Chandler6 tal processo à primeira vista dos mais simples, constitui um dos problemas sanitários de maior importância. Sendo assim, medidas alternativas de controle são bem vindas, e dentre elas, está o uso de fungos nematófagos, presentes no meio ambiente como uma alternativa viável e, cuja ação está concentrada no ambiente fecal e direcionada ao combate dos ovos e das larvas infectantes dos geohelmintos7.

Fungos predadores de nematoides é certamente o grupo mais estudado e que apresenta o maior potencial na destruição das formas infectantes de nematoides parasitos gastrintestinais de animais e humanos8. As espécies de fungos nematófagos Duddingtonia flagrans, Monacrosporium thaumasium e Artrobotrys robusta são identificadas como predadoras e têm sido estudadas como agentes controladores biológicos de nematoides potencialmente zoonóticos9.

O objetivo deste trabalho foi comparar a capacidade predatória in vitro, dos fungos das espécies Duddingtonia flagrans, Monacrosporium thaumasium e Artrobotrys robusta sobre L3 de Strongyloides stercoralis.

Foram utilizados três isolados de fungos nematófagos, um de Duddingtonia flagrans (AC001), um de Monacrosporium thaumasium (NF34) e um de Artrobotrys robusta (I-31). Esses isolados são oriundos de solo do Brasil, na localidade de Viçosa na zona da mata de Minas Gerais e são provenientes do Laboratório de Parasitologia da Universidade Federal de Viçosa. Os fungos foram mantidos em tubos de ensaio a 4ºC contendo corn-meal-ágar 2% e no escuro durante 10 dias. Após o crescimento dos isolados, novos discos de cultura de 4mm de diâmetro foram transferidos para placas de Petri de 9cm diâmetro contendo 20mL de ágar-água 2% (AA 2%) onde foram acrescidos de 1mL de água destilada contendo 1.000 larvas de Panagrellus sp, nematoide de vida livre, diariamente durante um período de 21 dias para indução da formação de conídios fúngicos. Quando se observou o completo desenvolvimento fúngico, 5mL de água destilada foram adicionados a cada placa de Petri, sendo que os conídios e fragmentos miceliais foram removidos segundo a técnica descrita por Araújo e cols10.

Coproculturas realizadas com fezes de um cão, naturalmente, infectado com Strongyloides stercoralis foram colocadas em aparelho de Baermann modificado para a recuperação das L311. A seguir, realizou-se o teste de predação em superfície de placas de Petri de 9cm de diâmetro preenchidas com AA 2% de acordo com técnica modificada por Mota e cols12. Foram formados quatro grupos, três grupos tratados com os fungos e um grupo controle (sem fungos). Nas placas de Petri, foram vertidos 0,1mL de solução contendo 5 x 103 conídios por ml (500 conídios) de cada fungo AC001, NF34, I-31 e 500L3 de Strongyloides stercoralis em cada grupo tratado. O grupo controle recebeu apenas 500L3 de Strongyloides stercoralis na superfície das placas de Petri. Foram realizadas seis repetições para cada grupo. Durante sete dias, a cada 24 horas, 10 campos aleatórios de 4mm de diâmetro em cada placa dos grupos tratados e controle foram observados em microscópio óptico em objetiva de 10x, contando-se o número de L3 não predadas em cada um. Ao final de sete dias, foram recuperadas as L3 não predadas do conteúdo das placas de Petri através do aparelho de Baermann com água a 42ºC. A média de L3 de Strongyloides stercoralis recuperadas foi calculada. Os dados foram interpretados estatisticamente pela análise de variância em níveis de significância de 1% de probabilidade.

A eficiência de predação de L3 em relação ao controle foi avaliada pelo teste de Tukey ao nível de 1% de probabilidade. Posteriormente, o percentual de redução da média de L3 foi calculado de acordo com seguinte equação:

Os isolados dos fungos predadores testados, Duddingtonia flagrans (AC001), Monacrosporium thaumasium (NF34) e Artrobotrys robusta (I-31) foram capazes de predar as L3 de Strongyloides stercoralis no teste in vitro. Comparando a captura e destruição das L3 de Strongyloides stercoralis nas placas de Petri dos grupos tratados com os fungos (AC001, NF34 e I-31), durante o experimento, foi observado que não houve diferença (p>0,01) na sua ação (Tabela 1). Contudo, diferença (p<0,01) foi observada entre as médias de L3 de Strongyloides stercoralis não predadas por campo de 4mm de diâmetro das placas do grupo controle em relação aos grupos tratados com fungos durante todo o experimento.

Os percentuais de redução de L3 observados no experimento para os fungos foram de: 83,7% (AC001); 75,5% (NF34) e 73,2% (I-31). Por outro lado, a presença das L3 de Strongyloides stercoralis nas placas de Petri contendo AA2% foi essencial para a formação das armadilhas pelos isolados fúngicos, uma vez que esse meio de cultura é pobre em nutrientes. Nas placas do grupo controle, não foi observada presença de fungos nematófagos durante o experimento. A comprovação da predação foi verificada pelas médias de L3 recuperadas por meio do método de Baermann no sétimo dia (Figura 1).

Dentre os helmintos com potencial zoonótico, destacam-se os do gênero Ancylostoma, Toxocara e Strongyloides5,9. Este último, além de sua importância médico-veterinária, requer atenção especial e investigação, uma vez que, infecta o homem causando perturbações gastrintestinais e anemia5. De acordo com Scowden e cols13, a estrongiloidíase é um grave e importante problema médico-social. Esses autores relatam que em indivíduos imunodeprimidos muitas vezes essa doença pode levar a morte, devido a sua facilidade de transmissão, a cronicidade e a autoinfestação. No Brasil, essa doença tem grande importância em saúde pública, cujas taxas de infecção variam de acordo com a região estudada. Por outro lado, as condições sanitárias e de higiene do indivíduo são diretamente proporcionais à infecção por Strongiloides stercoralis, uma vez que, seu desenvolvimento ocorre no meio ambiente5.

Nesse contexto, sugere-se a empregabilidade dos fungos nematófagos Duddingtonia, Monacrosporium e Artrobotrys, cuja capacidade predatória sobre L3 de nematoides parasitas gastrintestinais com potencial zoonótico tem sido comprovada7-9. Todavia, a capacidade predatória destes fungos nunca tinha sido testada sobre de L3 de Strongyloides stercoralis, sendo este, o primeiro relato da destruição de L3 deste nematoide. De acordo com Carvalho e cols9,estes fungos não são exigentes em relação a sua nutrição. Eren e Pramer14 mencionam que o fornecimento periódico de nematoides aos fungos em meio de cultura pobre em nutrientes reduziria o seu crescimento saprófita. Dessa forma, no presente trabalho foi utilizado apenas o meio AA2%, um meio pobre em nutrientes, com a intenção de reduzir o crescimento saprófita dos isolados fúngicos utilizados proporcionando apenas as L3 de Strongyloides stercoralis como fonte de nutrição. Ainda, segundo estes autores, quanto maior a mobilidade dos nematoides, maior o estímulo ao fungo para a produção de armadilhas. Este fato foi observado no presente trabalho, uma vez que, a formação de armadilhas e predação das L3 pelos isolados fúngicos foram visualizadas logo na primeira observação, ocorrida após 24h de interação.

Maciel e cols15 registraram que em meio de cultura AA 2% o fungo Artrobotrys robusta demonstrou maior atividade predatória sobre L3 de Ancylostoma sp, em relação aos demais fungos testados Duddingtonia flagrans e Monacrosporium thaumasium. Contudo, em trabalho recente Braga e cols8 registraram que em meio de cultura AA2% o fungo Duddingtonia flagrans demonstrou maior atividade predatória (80,3%) sobre L1 de Angiostrongylus vasorum em relação aos demais isolados utilizados Monacrosporium thaumasium (74,5%) e Artrobotrys robusta (71,8%). Estes resultados estão de acordo com o presente trabalho, uma vez que, a maior atividade predatória in vitro observada ao final do experimento sobre L3 de Strongyloides stercoralis foi para o isolado fúngico de Duddingtonia flagrans (AC001) em meio AA2%. No entanto, faz-se necessário à realização de mais pesquisas que possam demonstrar a interação destes e de outros fungos nematófagos sobre L3 de nematoides gastrintestinais com potencial zoonótico ajudando na sua diminuição ambiental e, por conseguinte, nas infecções.

Os resultados obtidos no presente trabalho confirmam trabalhos anteriores da eficiência dos fungos nematófagos Duddingtonia flagrans (AC001), Monacrosporium thaumasium (NF34) e Artrobotrys robusta (I-31) no controle de larvas de nematoides potencialmente zoonóticas.

CONFLITO DE INTERESSE

Os autores declaram não haver nenhum tipo de conflito de interesse no desenvolvimento do estudo.

SUPORTE FINANCEIRO

CAPES, FINEP/pro - equipamentos, CNPq e FAPEMIG.

REFERÊNCIAS

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6. Chandler RN. Introduction to human Parasitology. 4rd ed. Nova York and London; 1955. [ Links ]

7. Braga FR, Araújo JV, Campos AK, Carvalho RO, Silva AR, Tavela AO, et al. Observação in vitro da ação dos isolados fúngicos Duddingtonia flagrans, Monacrosporium thaumasium e Verticillium chlamydosporium sobre ovos de Ascaris lumbricoides (Lineu, 1758). Rev Soc Bras Med Trop 2007; 40:356-358. [ Links ]

8. Braga FR, Carvalho RO, Araujo JM, Silva AR, Araújo JV, Lima WS, et al. Predatory activity of the fungi Duddingtonia flagrans, Monacrosporium thaumasium, Monacrosporium sinense and Arthrobotrys robusta on Angiostrongylus vasorum first-stage larvae. J Helminthol 2009; 83:303-308. [ Links ]

9. Carvalho RO, Araújo JV, Braga FR, Araujo JM, Silva AR, Tavela AO. Predatory activity of nematophagous fungi on Ancylostoma ssp. infective larvae: evaluation in vitro and after passing through gastrointestinal tract of dogs. J Helminthol 2009; 83:231-236. [ Links ]

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Endereço para correspondência:

Dr. Fabio Ribeiro Braga

Deptº de Veterinária/UFV

Av. Ph Rolfes s/n

36570-000 Viçosa, MG

Tel: [phone]

e-mail: [email protected]

Recebido para publicação em 09/12/2009

Aceito em 07/04/2010