Emergence of multiple drug resistance in Vibrio cholerae isolated from patients with gastroenteritis in Ceará, Brazil

Abstract

Of 7058 Vibrio cholerae strains recovered from patients suspected of cholera in the State of Ceará between December 1991 and September 1993, two were resistant to antimicrobials (Ampicillin, erythromycin, trimethoprim-sulfamethoxazole, tetracycline) and to vibriostatic agent O/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridine). From the bacteriological standpoint, one strain was identified as V. cholerae serogroup O:1, biotype El Tor, serovar Inaba, and another as V. cholerae serogroup O:22, biochemically classified as Heiberg type II. It was shown that only in the serogroup O:1 strain, multiple resistance was encoded by a plasmid transferrable by conjugation to Escherichia coli K12 and a sensitive strains of V. cholerae O1 and non-O1, with at a frequency between 8x10-2 and 5x10-6. The plasmid, with a molecular weight of 147 Kb, encoded both multiple resistance to antimicrobials and the vibriostatic compound (O/129), compatible with descriptions reported in other parts of world.

ARTIGO

Emergência da múltipla resistência a antimicrobianos em Vibrio cholerae isolados de pacientes com gastroenterite no Ceará, Brasil

Emergence of multiple drug resistance in Vibrio cholerae isolated from patients with gastroenteritis in Ceará, Brazil

Ernesto Hofer, Bianca Ramalho Quintaes, Eliane Moura Falavina dos Reis, Dália dos Prazeres Rodrigues, Liliane Miyuki Seki, Iracema Sampaio Feitosa, Luiza Helena Feitosa Frota Ribeiro e Maria Rozzelê Ferreira

Resumo Das 7058 amostras de Vibrio cholerae isoladas de pacientes com suspeita de síndrome coleriforme, no período de 1991 a 1993, no Estado do Ceará, foram detectadas duas com as características de múltipla resistência aos antimicrobianos (tetraciclina, ampicilina, eritromicina, sulfametoxazol-trimetoprima) e ao composto vibriostático O/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropilpteridina). Do ponto de vista bacteriológico uma amostra foi identificada como V. cholerae sorogrupo O:1, biotipo El Tor e sorovar Inaba e a outra, caracterizada como V. cholerae sorogrupo O:22, classificada bioquimicamente no tipo II de Heiberg. Foi demonstrado que apenas na amostra do sorogrupo O:1, a multirresistência era codificada por um plasmídio, transferível por conjugação para Escherichia coli K12 e amostras sensíveis de V. cholerae O1 e não O1, numa freqüência entre 8x10-2 a 5x10-6. O plasmídio responsável pela multirresistência apresentou um peso molecular de 147 Kb, compatível com as descrições em outras partes do mundo.

Palavras-chaves: Vibrio cholerae O1 e não O1. Resistência antimicrobiana. Plasmídio. Cólera.

Abstract Of 7058 Vibrio cholerae strains recovered from patients suspected of cholera in the State of Ceará between December 1991 and September 1993, two were resistant to antimicrobials (Ampicillin, erythromycin, trimethoprim-sulfamethoxazole, tetracycline) and to vibriostatic agent O/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridine). From the bacteriological standpoint, one strain was identified as V. cholerae serogroup O:1, biotype El Tor, serovar Inaba, and another as V. cholerae serogroup O:22, biochemically classified as Heiberg type II. It was shown that only in the serogroup O:1 strain, multiple resistance was encoded by a plasmid transferrable by conjugation to Escherichia coli K12 and a sensitive strains of V. cholerae O1 and non-O1, with at a frequency between 8x10-2 and 5x10-6. The plasmid, with a molecular weight of 147 Kb, encoded both multiple resistance to antimicrobials and the vibriostatic compound (O/129), compatible with descriptions reported in other parts of world.

Key-words: Vibrio cholerae O1 and non-O1. Antimicrobial resistance. Plasmid. Cholera.

O primeiro ensaio sobre a tetraciclina na terapêutica da cólera foi realizado por Das et al6 na Índia, em 1951, embora a generalização do esquema, resultou das observações de Greennough et al13 e Carpenter et al4. Estes autores demonstraram que o processo de reidratação com as soluções eletrolíticas secundado com à tetraciclina, reduziam efetivamente a duração da diarréia e do volume de fezes espelidas, além de erradicar o vibrião colérico do trato entérico. Posteriormente, Mc Cormack et al21 analisaram o valor da tetraciclina em contatos ou comunicantes pertencentes as famílias com pacientes coléricos, constituindo-se no primeiro passo da quimioprofilaxia.

Nas décadas mais recentes, várias investigações abordaram o problema da resistência de Vibrio cholerae O1 à tetraciclina e outros antimicrobianos em diversas áreas, predominantemente na África9 19 22 25 32 e Ásia11 12 29 30.

Com a eclosão da epidemia na América Latina em 1991, um ano após no Equador foram caracterizadas amostras com múltipla resistência31, assim como, na Argentina27. Em nosso meio até meados de 1993, o problema não tinha sido detectado e que só no final desse ano, foram reveladas amostras de V. cholerae multirresistentes5 17.

O objetivo do presente trabalho foi analisar do ponto de vista bacteriológico, utilizando os métodos clássicos e moleculares, amostras de V. cholerae resistentes à tetraciclina e outros antimicrobianos.

MATERIAL E MÉTODOS

O material está representado por duas amostras resistentes à tetraciclina (IOC nº 12129 e IOC nº 13408), selecionadas das 7058 cepas de V. cholerae O1 e não O1, isoladas de 21030 coprocultivos realizados no período de 10/12/91 a 20/09/93, pelo Laboratório Central de Saúde Pública do Estado do Ceará.

A primeira amostra caracterizada como V. cholerae O1 El Tor, sorovar Inaba, recebeu o número IOC-12129, foi isolada de um paciente de 30 anos, agricultor no distrito de Catuana, município de Caucaia e hospitalizado no local em 11/09/93. As manifestações clínicas se concentraram na diarréia aquosa e profusa, com início em 06/09, acompanhada de dor abdominal, vômitos e desidratação moderada. Não fez uso prévio de qualquer medicação antimicrobiana.

No segundo caso, resultou no isolamento de V. cholerae não O1, sorovar O:22, pertencente ao grupo II de Heiberg tendo recebido o nº IOC 13408, de um agricultor do município de Orós. Foi hospitalizado no local em 16/09, informando que o início da diarréia aquosa com até 10 evacuações/dia, ocorreu no dia anterior, acompanhado de cólicas abdominais e vômitos. Ambos se recuperaram após a reidratação venosa e oral.

Todo o processo de isolamento e identificação preliminar e conclusiva, se baseou nas orientações de Hofer15 e do Manual de Diagnóstico Laboratorial de Cólera, Ministério da Saúde23.

Na análise da suscetibilidade aos antimicrobianos, tanto nas fase primária como da análise dos transconjugantes, adotou-se o método da difusão em agar24 com discos impregnados de ampicilina (10mcg), cloranfenicol (30mcg), eritromicina (15mcg), nitrofurantoína (300mcg), pefloxacina (10mcg), sulfametoxazol-trimetoprima. (23,75/1,25mcg) e tetraciclina (30mcg). A amostra padrão Escherichia coli ATCC 25.922 foi utilizada para o controle do antibiograma24.

A toxina colérica (CT) foi pesquisada através do processo de aglutinação passiva reversa em latex (Vet-RPLA), Oxoid.

Na pesquisa da conjugação das amostras resistentes a drogas (transferência de plasmídios) se recorreu ao método descrito por Dias e Hofer8 tendo como bactérias receptoras, Escherichia coli K12 C600 F-, Nalr; V. cholerae O1, Inaba, ATCC 14.033; V. cholerae O1, Inaba, Ceará, IOC nº 12.128; V. cholerae O1, Inaba, Ceará, IOC nº 13.203 e duas V. cholerae não O1:IOC nº 13.217, Ceará e IOC nº 14.910, Pernambuco. Todas eram sensíveis à tetraciclina e demais antimicrobianos. No cálculo da freqüência de transferência de plasmídios R, empregou-se a fórmula de Hermans et al14.

A análise do perfil do ADN plasmidial foi realizada segundo a técnica de Birnboim e Doly3, sem utilizar a lisozima na etapa inicial de lise, seguindo-se a eletroforese horizontal em gel de agarose a 0,6g% em tampão tris-borato pH 8.0 e da coloração com brometo de etídio (0,5µg/ml) por 15 minutos. Como marcadores de pesos moleculares dos plasmídios recorreu-se as amostras de Escherichia coli V517 e 39R861.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A resistência múltipla aos antimicrobianos em V. cholerae não é um fato inusitado, embora a sua projeção não se identifica com aquela que ocorre nos membros da família Enterobacteriaceae, excetuando Salmonella typhi. Aliás, o problema da pouca afinidade à resistência do vibrião colérico aos antimicrobianos apresenta certa similaridade ao do bacilo tífico.

É interessante que apesar da aplicação em larga escala da quimioprofilaxia com a tetraciclina nas áreas epidêmicas de cólera, particularmente na África, o fenômeno da resistência ao fármaco não foi tão patente, embora na literatura, fortuitamente se registrem surtos provocados por formas resistentes9 11 19 22.

Em nosso meio, de abril de 1991 a dezembro de 1993, nas 7.524 amostras de Vibrio analisadas pelo Laboratório de Referência Nacional de Cólera, provenientes das mais variadas partes do Brasil, excetuando-se as duas amostras, do Ceará, todas as demais foram sensíveis à tetraciclina, como ao cloranfenicol, nitrofurantoína e pefloxacina, mas com 25 e 7% resistentes à eritromicina e ampicilina17, respectivamente. Considerando as 7.058 cepas isoladas no Ceará nesse período, o nível de resistência à tetraciclina não ultrapassou a 0,03%.

A análise das características fenotípicas das duas amostras (Tabela 1), revela uma alteração importante do ponto de vista taxonômico. Assim, observa-se que ambas apresentaram resistência ao composto vibriocida O/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropilpteridina) até na sua concentração máxima (150µg). A importância do O/129 reside na sua capacidade de diferenciar através da suscetibilidade os membros do gênero Vibrio de outros bacilos Gram negativos, oxidase positivos, particularmente, Aeromonas. A totalidade das espécies de Vibrio, potencialmente patogênicos para o homem é sensível a concentração de 150µg, embora na Índia foram relatadas as ocorrências de V. cholerae O1 resistentes ao O/12926 28, assim como, em V. cholerae não O1 nos Estados Unidos da América1 e no Brasil18.

Um fenômeno interessante quanto a resistência de V. cholerae à pteridina relaciona-se que, às vezes estas bactérias também são resistentes à associação sulfametoxazol-trimetoprima, em especial, ao último fármaco. Isto decorre que ambas substâncias apresentam uma estrutura química comum, a diaminopirimidina segundo Matsushita et al20. Cabe ainda a estes autores a demonstração que esse marco genético era passível de transferência pela conjugação.

Do ponto de vista terapêutico, o problema se situa na multirresistência, envolvendo dois dos fármacos utilizados no tratamento da cólera33, a tetraciclina e sulfametoxazol-trimetoprima, este como eletivo para crianças, e em menor escala, a indicação da ampicilina e eritromicina (Tabela 1).

Sob o prisma clínico, salienta-se que a síndrome coleriforme foi indistingüível nos dois casos, embora um tenha sido provocado por V. cholerae O1 toxigênico, enquanto que no outro o agente etiológico, V. cholerae O:22, era desprovido da toxina colérica. Anteriormente, Hofer16, analisando um surto de gastroenterite na Bahia, isolou V. cholerae O:10 desprovido de toxina colérica, mas que era capaz de produzir in vitro uma toxina contra as células Y2 e in vivo, uma enterotoxina evidenciável em camundongos lactentes. Nos pacientes, os sinais clínicos eram idênticos à cólera. Em contraposição, Magalhães et al18 salientam nos seus achados em crianças que as amostras de V. cholerae não O1 não produziam toxina colérica; entretanto, curiosamente os espécimens fecais evidenciavam leucócitos, figura mais característica da síndrome disenteriforme ou invasiva. Sem dúvida este é um acontecimento muito raro, pois como conseqüência do mecanismo de agressão dos vibrios não coléricos predomina uma enterite de natureza não invasiva e muitas vezes indistinguível da cólera16.

A análise genética das cepas resistentes consistiu na tentativa de conjugação inicial com E. coli K12, verificando-se que apenas V. cholerae O1 -12.129 foi capaz de transferir um plasmídio com resistência à tetraciclina, sulfametoxazol-trimetoprima e a pteridina (O/129), obtendo-se como freqüência de transferência 3,6 x 10-5. Em seqüência com o transconjugante carreando o plasmídio, foram realizadas as experiências visando transferir o fator de resistência para as culturas de V. cholerae O1 e não O1, sensíveis aos antimicrobianos, incluindo a pteridina. Todas as amostras de vibrios foram receptíveis à transferência por conjugação, numa freqüência que variou entre 8 x 10-2 (IOC-14.910) a 5 x 10-6 (IOC-12.128), mas, selecionando-se como referência a amostra padrão 14.033-ATCC, com 5 x 10-3 de taxa de transferência. Os níveis de resistência aos antimicrobianos foram confirmados nos novos transconjugantes.

A análise plasmidial da amostra V. cholerae O1-12.129, revelou um plasmídio distinto de peso molecular de aproximadamente 147Kb, transferível para a receptora K12, assim como, ao transconjugante V. cholerae 14.033 ATCC, codificando tanto a múltipla resistência os antimicrobianos como ao composto O/129 (Figuras 1 e 2). Assinala-se que este fenômeno não ocorreu com a amostra de V. cholerae O:22 (IOC-13.408), desprovida de plasmídio. Considerando apenas a resistência à pteridina e ao sulfametoxazol-trimetoprima, segundo Gerbaud et al10, isto decorreria pela mediação de plasmídios e transposons, sendo que pelo último poderia haver a integração ao cromossoma e, desta forma, se perpetuar na bactéria. É possível que este mecanismo tenha ocorrido na amostra de V. cholerae O:22, tendo em vista a ausência do plasmídio de 147Kb, assim como, de qualquer outro que possibilitasse a transferência.

Um aspecto importante, refere-se a similaridade do presente resultado em relação ao peso molecular desse plasmídio conjugativo com os diversos estudos efetivados.com amostras de V. cholerae O1 e não O1 isoladas na Ásia2 11 12 29, África9 25 e América do Sul31, caracterizando plasmídios de pesos na faixa de 98 a 115Mda, com predominância de 100Mda.

Finalmente, assinala-se a estabilidade do plasmídio na amostra isolada em 1993 e manuseada rotineiramente no laboratório durante cinco anos, sem perder o fator de resistência. Aliás, Yokota et al34, enfatizavam a instabilidade do fator R, em temperaturas em torno de 42-43oC, porém estável a 25oC razão pela qual, admitem uma importância do mecanismo de transmissão de fator R no meio ambiente. Todavia esta hipótese não encontra o devido respaldo na análise efetuada em amostras de V. cholerae não O1 isoladas de estações de tratamento de esgotos da cidade do Rio de Janeiro7.

Em síntese, o presente achado reforça a posição da Organização Mundial da Saúde33, orientando para a execução rotineira do antibiograma nas amostras de V. cholerae O1 isoladas dos processos entéricos, do ambiente e de alimentos, como medida de sentinela do aparecimento de formas resistentes.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Dr. T. Shimada do National Institute of Health, Tokyo, Japan, pela caracterização antigênica do víbrio não colérico, as Drs. Nilma Cintra Leal e Tereza Cristina Arcanjo Leal do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Recife, pela análise plasmidial efetuada e aos serviços técnicos prestados por Deise Paranhos Feitosa, Junair Ribeiro e Darcília Maria de Andrade.

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Laboratórios de Zoonoses Bacterianas e de Enterobactérias do Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ e Laboratório Central de Saúde Pública do Estado do Ceará, Fortaleza, CE.

Apoio financeiro parcial: CNPq e Coordenadoria de Laboratórios (COLAB) da Fundação Nacional de Saúde.

Endereço para correspondência: Dr. Ernesto Hofer. Deptº Bacteriologia/IOC/FIOCRUZ, Av. Brasil 4365, Manguinhos, 21045-900 Rio de janeiro, RJ, Brasil.

Recebido para publicação em 21/5/98.