土壤微生物是土壤生态系统中最重要和最活跃的组分[1, 2]，因其丰富的多样性和土壤修复能力，被视为土壤生态环境恢复的先锋者，在改善土壤养分循环、增加系统稳定性以及土壤可持续利用方面发挥主导作用[3, 4]。近30年随着现代农业的发展，大量农药、化肥、饲料添加剂等进入土壤和水体，严重污染土壤微生态环境，杀灭大量土壤动物，干扰微生物酶活性和呼吸代谢等过程，破坏微生物多样性，导致土壤板结、肥力下降、病原菌滋生等生态系统严重退化现象[5]，降低土壤可持续生产力，最终威胁农业生产安全和人类健康[6]。生物耕作是目前制衡化学品乱投入，减少土壤物理结构人为过度扰动，增加土壤微生物多样性、平衡土壤肥力的一种土壤质量维系、土壤功能改善和土壤障碍修复的有效措施之一。生物耕作是指不采用任何人为和机械的土壤扰动，仅在土壤中引入有益生物，施用有机肥等有机物质维持其生存，并使之固定在一定区域活动，利用蚯蚓对土壤的机械翻动、吞食和消化等动物生理行为，可有效改善土壤的团粒结构、提高通气性和透水性，疏松土壤、改良土壤物理结构，调控土壤微生态环境，平衡土壤矿质元素，实现农田生态环境保护与节能减排的一种新型农业耕作方式[7, 8]。大量研究已经证实蚯蚓在有机质的分解和土壤物质营养循环中发挥重要的作用，是一种处理有机废物、消除土壤污染、增加土壤肥力和植物产量等的有效措施[9, 10]，李典友等[11]研究发现在森林土壤中，蚯蚓吞食和转化的有机质总量每年每公顷林地可达1 t以上，促进了有机质的腐殖质化和复合体的形成，使土壤中的腐殖质提高0.36～1.50倍，土壤的保肥能力可提高25%～42%。同时蚯蚓活动也可增加土壤微生物活力、繁殖力和数量[12, 13, 14]。以往研究多基于调查，或者是蚯蚓添加作为辅助手段，而没有将蚯蚓作为农业生产中的主体动力和力量群，本研究拟在菜田中采用生物耕作的方式，设立长期定位试验，探讨在此模式下，完全的蚯蚓生物耕作时间对菜田土壤中微生物的多样性和碳代谢特征的影响，为生物耕作模式的优化和进一步研究提供数据支撑。
1 材料与方法
1.1 试验地点
研究地点位于上海市崇明岛西部的三星镇（31°41′15″N，121°54′00″E），平均海拔4 m。该区属北亚热带季风气候，盛行东南风，温暖湿润，四季分明，光照充足，夏季湿热，冬季干冷。台风、暴雨、干旱等是常见的灾害性气候。年均降水量1 004 mm，降水集中在4—9月；年均气温15 ℃，10 ℃以上的年均积温2 560 ℃；无霜期229 d，年日照时数2 104 h。
1.2 试验设计
试验开始于2009年6月，设置无机械无蚯蚓的免耕对照（CK），无机械而仅有威廉环毛蚓（Pheretima guillelmi，上海富年药材有限公司提供）耕作1年（BT1）、2年（BT2）和3年（BT3） 4个处理，每个处理设置3个重复。小区面积240 m2，蚯蚓投放密度为25条·m-2（每年实验开始时进行取样测数，多则移除，少则添加，保持25条·m-2）；不同处理小区间开挖80 cm深的水沟，限制蚯蚓活动范围。施用普通商品有机肥（含有机质413.4 g·kg-1，N 17.1 g·kg-1，P2O5 12.4 g·kg-1，K2O 12.3 g·kg-1）作为蚯蚓的食物来源，施用量为1 t·667 m-2。免耕和耕作3年处理于2009年开始试验，耕作2年处理于2010年、耕作1年处理于2011年开始投放蚯蚓。种植作物为芋艿（Colocasia esculenta L. Schoot）与花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis L.）的轮作模式，作物生长期间不施化肥，以防化学肥料影响蚯蚓的活性。
在各种植季作物收获后采集土壤样品，用直径2 cm的不锈钢采土器采集深度0~5 cm和5~20 cm土层土壤，在样地内按“S”形线路采集数个土样，混合后装入塑料封口袋中，并置于低温保鲜盒中带回实验室。一部分样品风干后测定土壤基本理化性质（表 1），一部分样品在4 ℃保存用于测定土壤微生物性状指标。
Enlarge this image.表 1 不同生物耕作年限对土壤理化性状变化的影响 Table 1 Effect of different biological tillage years on soil physicochemical properties
1.3 测定方法
1.3.1 采用Biolog生态微平板法分析土壤微生物功能代谢特征
每块板包含同一处理的3个重复。具体操作如下：称取相当于5.00 g干土重的新鲜土壤，加入到45 mL灭菌0.85%（W/V）NaCl溶液中，振荡30 min后取出静置5 min，吸取土壤上悬液2 mL稀释至18 mL 0.85%NaCl无菌溶液三角瓶中，吸取稀释液接种到生态板，每孔接种量150 μL，所有操作均在无菌条件下进行。接种的生态板于25 ℃培养，分别于24、48、72、96、120 h和144 h在590 nm光波长测定吸光度值。Biolog生态微平板和Biolog Reader购自美国BIOLOG公司（BIOLOG，Hayward，USA）[15]。
1.3.2 土壤中蚯蚓数量的测定
测定方法为福尔马林法，将化学试剂加在土壤表面引蚯蚓出来，然后收集蚯蚓并计数。具体方法是做一个1 m×1 m的框架，把框架插入土壤，把15 L福尔马林（含量0.55%V/V）施在土壤表面，在框架中收集蚯蚓20 min [16]。
1.4 数据处理
采用Biolog生态测试法研究土壤微生物群落代谢功能之间的差异。不同时刻微生物对碳源的代谢特征用每孔颜色平均变化率（Average well-color development，AWCD）来表示。
AWCD的计算公式为：AWCD=∑（C-R）/n
式中，C为Biolog生态微平板每个接种微生物的微孔的光密度值，R为空白微孔的光密度值，n为碳源底物种类，n=31。
采用培养120 h的Biolog生态平板孔中吸光值来计算土壤微生物群落功能多样性指数，公式为：
式中：Pi为第i孔相对吸光值（C-R）与整个平板相对吸光值总和的比率。
Pielou均匀度：E=HlnS，S为颜色变化孔的数目。
Simpson指数：D=1-ΣPi2。
将Biolog微平板31种碳源分为6类，分别对0~5 cm和5~20 cm土层中微生物培养120 h的AWCD值标准化后进行主成分分析（PCA），评价生物耕作各处理对土壤微生物群落的碳源代谢特征影响。试验数据应用Excel和SPSS 13.0统计软件进行统计分析[17]。
2 结果与分析
2.1 威廉环毛蚓耕作时间对菜园土壤微生物群落活性的影响
微平板AWCD值是反映土壤微生物群落活性的一个重要指标，指示了微生物对各类碳源的利用情况和微生物群落的总体活性[18]。研究表明，耕作措施对微生物代谢活性产生显著的影响（P<.05），各处理AWCD值的大小顺序依次为BT>BT>BT>CK，表明生物耕作显著提高了微生物群落活性；随着培养时间的延长，基质中碳源逐渐被微生物生长代谢所消耗，所有处理中AWCD值均呈升高（P<.05）趋势，在120 h时出现拐点，既微生物对基质碳利用达最强（图 1）。各处理土壤微生物活性的高低也受到土层深度的影响，0~5 cm土层土壤微生物活性的高低依次为BT>BT>BT>CK，而5~20 cm土层依次为BT>BT>BT>CK。利用蚯蚓进行的生物耕作，随着实施时间的延长，表层微生物群落功能多样性逐渐增加，但深层微生物多样性出现无规律变化。不同土层土壤微生物活性增加速率也不同，随培养时间的延长0~5 cm土层在培养前期土壤微生物活性增速较快，在120 h时出现拐点，而5~20 cm土层土壤微生物活性前期升高较慢，且整个培养期间均呈现升高的趋势，也表明土层不同而对微生物的影响不同。
Enlarge this image.图 1 不同生物耕作年限对0~5 cm（a）和5~20 cm（b）土层土壤AWCD 值影响随培养时间的变化 Figure 1 Changes of soil microbial metabolic characteristics(AWCD values)with different biological farming years in 0~5 cm(a)and 5~20 cm(b)soils
同一耕作时间内土层深度也会影响土壤微生物活性，培养120 h时免耕和生物耕作1年处理的上层（0~5 cm）土壤微生物活性显著低于下层（5~20 cm），而生物耕作2年和3年的土壤微生物活性则是上层高于下层（P<.05），这说明土层深度显著影响了蚯蚓活动对土壤微生物的作用。
2.2 威廉环毛蚓耕作时间对菜园土壤微生物群落多样性的影响
土壤中不同微生物功能类群对基质各类碳源具有选择性，生物多样性指数用以指示利用不同碳源的微生物种类的丰富程度。表 2中是微生物培养120 h时各处理的多样性指数，不论在0~5 cm土层还是5~20 cm土层，生物耕作处理Simpson指数和Shannon指数均显著高于免耕对照，在0~5 cm土层累积增幅分别为49和6.28，5~20 cm土层累积增幅分别为31和2.55；不论0~5 cm土层还是5~20 cm土层中，不同处理间均匀度指数差异不显著。
Enlarge this image.表 2 不同生物耕作年限对0~5 cm 和5~20 cm土层土壤微生物群落多样性指数的影响 Table 2 Effects of different biological tillage years on functional diversity index of soil microbial community in 0~5 cm and 5~20 cm soils
2.3 威廉环毛蚓耕作后菜园土壤微生物对各类碳源的利用情况变化
研究土壤微生物对不同碳源的利用能力，有助于更全面了解微生物群落代谢和功能群组成特征[19]。通过对不同生物耕作年限处理土壤微生物群落代谢多样性类型的比较，可以分析生物耕作时间长短及土层深度对土壤微生物群落代谢多样性的影响。将0~5 cm和5~20 cm土层中微生物碳源代谢特征120 h时测定的吸光度值进行标准化处理，然后进行主成分分析（PCA），评价不同生物耕作年限处理土壤微生物群落在碳源利用上的整体差异。对土壤微生物群落利用Biolog微平板中6类碳源的情况进行主成分分析，提取的前4个主成分因子的贡献率与累积贡献率。从表 3可以看出，变换后前4个主成分可以解释90%（0~5 cm：98.4％，5~20 cm：93.6％）以上原变量的特征，并且主成分的重要性逐渐降低。
Enlarge this image.表 3 前4 个主成分因子的贡献率与累积贡献率 Table 3 Contribution ratios and accumulated ratios of the first 4 principal components
应用主成分分析方法研究生物耕作对微生物群落代谢的影响，取第一、第二主成分做双轴图表征微生物的代谢特征（图 2）。对0~5 cm土壤微生物的PCA分析中第一、第二主成分解释了总变异的71.6%，前4主成分解释了98.4%。0~5 cm土层双轴图中，生物耕作与免耕处理的样点分布存在明显的分离，而生物耕作1年、2年和3年样点互相重叠。生物耕作的样点主要集中沿纵轴正向分布，大部分集中于第一象限，生物耕作2年处理样点分布较分散，沿纵轴梯度分离，生物耕作3年样点集中于原点周围。
Enlarge this image.图 2 不同耕作年限对不同土层土壤0~5 cm（a）和5~20 cm（b）微生物碳源利用主成分分析双轴图 Figure 2 0~5 cm(a)and 5~20 cm(b)soil layers similar microbial community carbon source utilization comparison of different biological farming years
5~20 cm土壤微生物PCA分析中前2个主成分解释了总变异的72.2%，前4主成分解释了93.6%。生物耕作与免耕处理的样点出现明显的分离，2年与3年处理样点间也出现分离。生物耕作3年样点主要分布于第一象限，生物耕作2年样点集中于原点周围，免耕样点分布于图左侧。5~20 cm土层各处理样点沿横轴出现分离。
3 讨论
土壤微生物促进土壤养分循环转化，对于土壤肥力形成意义重大[20]。土壤微生物对周围环境较敏感，群落多样性容易受到外界环境条件的影响[21]，传统耕作模式对土壤生态环境干扰强度大，显著降低土壤微生物活性。而近年来以免耕模式为代表的一种减少和排除人为机械和外力干扰的耕作模式，为微生物生长提供了稳定土壤环境，有助于微生物多样性增加和活性的增强[19]，已被认可为保护土壤微生态，提高和维持土壤质量与肥力的手段，广泛采用。在免耕基础上投放适宜数量的大个体、高食量的土著蚯蚓种类，利用蚯蚓活动、取食、代谢和排泄等的行为，用来进行高强度利用下农田土壤生态维护与修复，可在较短的时间内，使得土壤微生物代谢AWCD值较免耕处理增强3~7倍，意味着蚯蚓活动显著提高了微生物群落代谢活性，且随着耕作时间增长微生物代谢活性增高，可能是因为生物耕作有助于耕层土壤微生物数量的增加有关[22]。但是0~5 cm土层和5~20 cm土层的变化幅度不同，本实验中0~5 cm土层和5~20 cm土层土壤含水量存在较大差异，也可能对土壤微生物活性产生一定影响。蚯蚓通过翻动土壤、取食植物碎屑和有机残体及排泄行为，可有效改善土壤的团粒结构、提高通气性和透水性，调节土壤pH值，进而改变土壤酶活性，改变土壤微生物的群落结构和功能特征[23, 24, 25]。本实验投放蚯蚓种类是威廉环毛蚓（Pheretima guillemi），具有在土壤表层摄食、在土壤深层栖息的习性。
研究土壤微生物对不同碳源的利用能力，有助于更全面了解微生物群落代谢和功能群组成特征[19]。生物耕作微生物的Simpson指数和Shannon指数显著高于免耕对照，而且随耕作年限的延长而增加，投放蚯蚓和增加生物耕作年限显著增加微生物对6类碳源的代谢能力，耕作3年碳水化合物代谢活性大幅增加。通过对土壤微生物群落代谢功能的主成分分析，同样可以看出免耕对照与生物耕作处理间微生物代谢功能差异很大。免耕土壤微生物对各类碳源的利用率低，以胺类为主；而经生物耕作处理后土壤微生物对碳源的利用范围增大，碳水化合物和氨基酸利用率大幅增加。随时间延长蚯蚓作用强度增加后效应显现，表层微生物代谢能力超过深层，生物耕作2年和3年土壤表层（0~5 cm）AWCD值高于深层（5~20 cm）。这与张宝贵[26]和于建光等[27]在添加蚯蚓并覆盖秸秆有助于提高稻麦轮作土壤微生物代谢活性的研究结论一致。本实验在农田表层投撒有机肥，实验期间未进行机械翻耕，施加的有机肥主要集中在土壤表层，吸引蚯蚓向表层活动，因而表层微生物代谢随时间延长的变化规律比较明显，蚯蚓耕作对表层具有更强的促进效果。蚯蚓吞食消耗有机质对深层微生物的碳源产生较小且不规则影响，导致下层微生物代谢多样性的不规则波动。
4 结论
（1）在菜园土中添加蚯蚓进行生物耕作，可显著提高了微生物群落活性，生物耕作3年可使平均微生物群落活性升高3~7倍，随着耕作年限的延长生物耕作促进土壤微生物活性增加值越高。
（2）生物耕作处理使得土壤微生物多样性指数如Simpson指数和Shannon指数均显著高于免耕对照，分别累积增加31～49和2.55～6.28。同时蚯蚓进行生物耕作，使得土壤微生物对6类碳源的代谢能力显著增强，生物耕作3年后土壤微生物对碳水化合物代谢活性大幅增加。
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