Hypoxia-Reoxygenation Induced Cardiac Mitochondrial Dysfunction

Abstract

Objectives:

Cellular response to low oxygen tension is altered by severity and duration of hypoxia. Although the subject has been studied extensively, mechanisms leading to hypoxia-reoxygenation damage remain undefined. Here, we investigated the effect of long term continuous hypoxia (48 hours) on cardiac derived HL-1 cells, mainly the role of mitochondria in cellular energy and reactive oxygen species homeostasis.

Materials and Methods:

In this study, mammalian atrium derived HL-1 cells were cultured either in long term hypoxia (48 hours, 1% O₂) or in normoxia (48 hours, 21% O₂) conditions. Mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species (ROS) level was measured using florescent dyes in a confocal microscope. GAPDH protein levels were detected by western blotting in normoxic control and hypoxic cells.

Results:

Present results demonstrate that, 48 hours of hypoxia did not alter baseline mitochondrial membrane potential and its oxidative respiration capacity in cardiac HL-1 cells. The mitochondrial depolarization response to in reoxygenation period of oxygen deprived cells was slower in hypoxic cells. In hypoxic cells, basal ROS levels were higher whereas hydrogen peroxide response was smaller when compared with the normoxic control group. GAPDH protein levels were unaltered between groups.

Conclusion:

Present results indicate that, persistent mitochondrial oxidation phosphorylation uncoupling may lead to an over production of ROS.

Alternate abstract:

Amaç:

Hücrelerin azalan oksijen konsantrasyonuna verdikleri yanıt hipoksinin şiddeti ve süresine göre değişiklik göstermektedir. Bu konuda oldukça fazla çalışma yapılmış olmasına karşın, hipoksi ile indüklenen fonksiyonel yanıtların altında yatan mekanizmalar büyük ölçüde aydınlatılamamıştır. Bu çalışmada, kardiyak kökenli HL-1 hücrelerinin, uzun süreli (48 saat) kesintisiz hipoksiye verdikleri yanıtta mitokondrinin hücresel enerji ve reaktif oksijen türevleri (ROS) dengesindeki rolü araştırılmıştır.

Gereç ve Yöntem:

Bu çalışmada memeli atriyum kökenli hücre serisi HL-1 hücrelerinde uzun süreli hipokside (48 saat, %1 O₂) ve normoksik (48 saat, %21 O₂) şartlarda kültür edilmiştir. Normoksik kontrol ve hipoksik hücrelerden mitokondri membran potansiyeli ve ROS miktarı floresan boyalar ile konfokal mikroskopta ölçülmüş, GAPDH protein seviyeleri western blot yöntemi ile belirlenmiştir.

Bulgular:

Sonuçlarımıza göre, kardiyak HL-1 hücrelerinde 48 saat hipoksi bazal mitokondri membran potansiyeli ve oksijenli solunum kapasitesini değiştirmedi. Bununla birlikte hipoksik hücrelerin reoksijenasyon sırasında ortamdan tekrar oksijen uzaklaştırılmasına olan mitokondriyal depolarizasyon yanıtları normoksik kontrol hücrelere göre yavaştı. Hipoksik hücrelerde bazal ROS miktarında artış gözlenirken, hidrojen peroksite olan yanıtlar normoksik kontrol grubuna göre azaldı. GAPDH protein seviyesinde gruplar arası bir fark saptanmadı.

Sonuç:

Bu sonuçlar, uzun süreli hipoksi ile indüklenen mitokondriyal oksidatif fosforilasyon kenetindeki kalıcı disfonksiyonun hücresel ROS artışından sorumlu olabileceğini düşündürmektedir.

Giriş

Mitokondriyal disfonksiyon, kardiyak iskemi-reperfüzyon hasarı ve kanser gibi hipoksi ile ilişkili kompleks hastalıklarda gözlenen ortak bir bulgudur (1,2). Hücrede normoksik (%21 O2) mitokondriyal solunum sırasında elektron donörleri nikotinamit adenin dinükleotit ve flavin adenin dinükleotit’den gelen elektronlar sırası ile mitokondri iç membranında kompleks 1 ve 2 olarak adlandırılan solunum zinciri proteinlerine transfer edildikten sonra kompleks 3’e taşınıp moleküler oksijen tarafından yakalanır. Son olarak, sitokrom oksidaz enzimi kompleks 4 ile etkileşip oksijen ve suya indirgenir. Mitokondriyal komplekslerin bu işlevi sonucu mitokondri iç membranında oluşan proton gradienti, hücrede adenozin trifosfat (ATP) sentezi için gerekli enerjiyi sağlar. Böylece mitokondri ATP üretimi için ana metabolik yolak olan oksidatif fosforilasyon ile hücredeki oksijenin %85-90’ını tüketir. Kardiyak iskemik bozukluklar gibi hücreye az oksijenin ulaştığı hipoksi durumlarında yetersiz ATP üretimi (glikolitik yolaktan ATP üretimi verimsiz olduğundan) hücrenin ölümüne gidebilecek yolakları tetikleyebilir. Bu durumu engellemek amacıyla bazı memeli hücre tiplerinin hipoksi sırasında bozulan oksidatif fosforilasyonun sonucu azalan ATP üretimini telafi etmek için genellikle glikolizde ve glukoz transport yolağında görev alan genlerin ekspresyonunun arttığı bilinmektedir (3-6). Normokside, mitokondriyal elektron transport zincirinde oksijenin yaklaşık %2-3’lük kısmının suya indirgenerek ATP üretimi yerine reaktif oksijen türevleri (ROS) oluşturduğu tahmin edilmektedir (7). Hipokside ise, oksijen miktarının azalması ve mitokondriyal solunumun durmasından dolayı mitokondriyal ROS üretiminde azalma bildirilmiştir (2,8). Ancak, hipoksinin mitokondriyal ROS üretiminde beklenenin aksine artışa yol açtığını bildiren çalışmalar da bulunmaktadır (9). Hipoksi sırasında hücre içi ROS artışından mitokondriyal elektron transport zincirindeki disfonksiyonel kompleks 1 ve 3’ün sorumlu olabileceği düşünülmektedir (9,10). Ayrıca, mitokondriyal dinamiklerdeki değişikliklerin de hipokside ROS artışına yol açabileceği bildirilmiştir (11).

Daha önceki bulgularımıza göre, HL-1 hücrelerinde 48 saat hipoksi sonrası 2 saat reoksijenasyon ile, azalan hücre içi ATP miktarı yerine konmamıştır (12). Bu sonuç, hipokside gelişen kalıcı mitokondriyal disfonksiyonun reoksijenasyonda mitokondride oksidatif fosforilasyon eşleşmesi yerine ROS üretimine kaydığını düşündürmektedir. Bu hipotezi test etmek amacıyla, çalışmamızda, 48 saat hipokside mitokondri fonksiyonu ile hücredeki bazal ROS miktarı araştırılmıştır.

Gereç ve Yöntem

Hücre Kültürü ve Uzun Süreli Hipoksik Şartların Oluşturulması

Fare atriyal tümör kökenli HL-1 hücreleri uygun şekilde kültür edildi (13). Hücreler, Claycomb (Sigma) besiyeri içeren yuvarlak camlara ekildi ve %21 O2, %5 CO2’de 24-36 saat tutuldu. %70 yoğunluğa ulaşan hücreler, 6 mL Claycomb besiyeri içeren 60 mm petri kaplarına aktarıldı. Hipoksi için, hücreler oksijen konsantrasyonunun paralel ölçüldüğü (Oxymicro, WPI) kapalı kap (Billups-Rothenberg, Inc.) içerisinde 48 saat %1 O2, %5 CO2, %94 N2’de tutuldu. Kapalı kaptaki oksijen gazının dengelendiği 1. ve sonrasında 24. saatlerde kabın gaz içeriği yenilendi. Kontrol normoksik hücreler ise, 48 saat boyunca %21 O2 ve %5 CO2’de tutuldu. Bu protokol ile, hipoksi ve kontrol deneylerin sonunda hücre besiyeri pH’si ~7,4 olarak ölçüldü.

Western Blot Analizi

HL-1 hücrelerinde GAPDH miktarını ölçmek amacıyla hücreler ilk başta +4 ˚C’deki fosfat tamponlu salin çözeltisi ile yıkandıktan sonra kazındı ve pellet haline getirildi (+4 ˚C, 1000 g, 5 dakika). Tüm proteinleri elde etmek için, pellet deterjan içeren çözeltide [50 mM HEPES (pH: 7,6)], 150 mM sodyum klorür, 1 mM etilendiamin tetraasetik asit, 1,5 mM magnezyum klorür2, %0,5 NP-40 ve proteaz inhibitör kokteyli (Complete, Roche) düzenli aralıklar ile karıştırılarak 15 dakika boyunca +4 ˚C’de tutuldu ve süpernatant alındı (13750 g, 10 dakika, +4 ˚C). Daha sonra, poliakrilamid jel elektroforez ile ayrıştırılan proteinler polivinilidin florür membrana (Santa Cruz) aktarıldı ve fare monoklonal antikorları GAPDH (Santa Cruz, 1/1000) ve β-aktin (Santa Cruz, 1/1000) ile işaretlendi. Protein görüntülenmesi için ECL ve yaban turpu peroksidaz -konjuge tavşan anti fare antikoru (Abcam, 1/25000) kullanıldı. Film dansitometrik analizi ImageJ yazılımı ile yapıldı. GADPH protein seviyesi β-aktin miktarına normalize edildi.

Reaktif Oksijen Türevleri Ölçümü

Hücrelerdeki reaktif oksijen türevlerinin (süperoksit, O2^-; hidroksil radikali, OH singlet oksijen, ¹O2; hidrojen peroksit, H2O2) ölçümü için floresan özellikteki klorometil-2’,7’-diklorodihidrofloresein diasetat (CM-DCFDA) kullanıldı. 30 dakika 37 ˚C’de CM-DCFDA (10 mM) ile inkübe edilen hücreler 488 nM dalga boyunda uyarıldı ve 535 nM dalga boyundaki floresan emisyon konfokal mikroskop ile 37 ˚C’de toplandı (TCS SP5, Leica).

Mitokondri Membran Potansiyeli Ölçümü

HL-1 hücrelerinden mitokondriyal membran potansiyeli ölçümü için 1,1’,3,3’-tetra etil benzamidazol karbosiyanin iyodür (JC-1, Anaspec) floresan boyası kullanıldı. Kırk sekiz saat hipokside tutulan hücreler hipoksiden alındıktan sonra 20 dakika 37 ˚C’de JC-1 (5 mM) ile yüklendi. Potansiyometrik JC-1 boyası, mitokondri polarize olduğunda mitokondriyal membranlar arasında toplanarak (j-agregat formu) kırmızı floresan (590 nM) artışı gösterir. Mitokondriyal depolarizasyon ise, boyanın diffüz bir şekilde sitoplazmaya dağılmasını sağlar ve boyanın bu formu yeşil floresan (530 nM) özelliktedir. 488 nm’de uyarılan hücrelerden elde edilen emisyon eş zamanlı (ratiometrik) olarak 530 nM ve 590 nM’de 37 ˚C’de konfokal mikroskop ile toplandı (TCS SP5, Leica). Bazal emisyon oranları Leica yazılımı ile ölçüldü.

İstatistiksel Analiz

Bu çalışmada kontrol ve 48 saat hipoksi bağımsız deney gruplarında deneysel protokol uygulamaları sonrasında oluşan yanıt ortalamaları student’s t-testi ile karşılaştırılmıştır. P<0,05 anlamlı kabul edilmiş ve sonuçlar ortalama ± standart hata olarak gösterilmiştir.

Bulgular

HL-1 Hücrelerinde 48 Saat Hipoksi Sonrasında Reoksijenasyon Mitokondriyal Membran Potansiyelini Değiştirmedi

Uzun süreli hipoksi sonrasında 2 saatlik reoksijenasyon süresinde ölçüm alınan hücrelerdeki ψ, normoksik kontrol hücrelerden farklı değildi (Şekil 1a, 1b). Sodyum ditionit, uzun süreli hipoksik ve kontrol hücre ψ’ini güçlü bir şekilde depolarize etti ve gruplar arası fark saptanmadı (Şekil 1a, 1b). Ancak, 48 saatlik hipoksi grubunda sodyum ditionit’in oluşturduğu ψ depolarizasyon cevabı kontrol grubuna göre daha yavaştı (Şekil 1c).

Uzun Süreli Hipoksi Glikoliz Yolağında Rol Alan GAPDH Protein Ekspresyonunu Etkilemedi

HL-1 hücrelerinde hipoksi sırasında glikolitik yolaktan enerji üretiminde rol alan ana enzimlerden GAPDH seviyesi ölçüldü. HL-1 hücrelerinde 48 saatlik uzun süreli hipoksi GAPDH protein miktarını değiştirmedi (Şekil 2a, 2b).

48 saat Hipoksi ve Reoksijenasyon Hücresel Ros Oluşumunu Artırdı

HL-1 hücrelerinde ROS ölçümü için, 48 saatlik hipokside tutulan hücreler hipoksik ortamdan çıkartıldıktan sonra normoksik koşullarda (%21 O2, 37 ˚C) membrandan geçebilen hücre içi ROS boyası (CM-DCFDA) ile 30 dakika inkübe edilerek yüklendi. Normoksik kontrol hücrelerindeki bazal ROS sinyali, hidrojen peroksit (1 mM, H2O2) uygulaması ile ~%50 arttı (Şekil 3a, 3b). 48 saatlik hipoksi grubunda, bazal ROS miktarında kontrol grubuna göre artış gözlenirken, normoksik kontrol grubundaki H2O2 yanıtı ise ortadan kalktı (Şekil 3a, 3b).

Tartışma

Hücredeki oksijen miktarı hücre metabolizması ve gen ekspresyonunu belirleyen bir faktördür. İzole veya iskeminin eşlik ettiği hipokside hücrelerin Krebs döngüsü hızında azalma ve hipoksi ile indüklenen faktör (hif) aracılı değişiklikler olmaktadır. Hipoksik şartlarda hücreler glikozu daha çok kullanarak ATP’yi az verimli oksijensiz solunum (glikoliz ve laktat oluşumu) ile elde ederler (Pastör etkisi). Bu koşullarda, mitokondri yeterli substratlar ile (asetil-CoA ve oksijen) beslenemediğinden yapısı, fonksiyonu ve dinamiklerinde önemli değişiklikler oluştuğu bildirilmiştir (14).

Daha önceki çalışmalarda, uzun süreli hipoksinin mitokondri membran geçirgenliğini artırarak mitokondri membran potansiyelini (ψ) depolarize edebileceği öne sürülmüştür (15,16). Bu bulguların aksine sonuçlarımız, ortamdan oksijenin uzaklaştırıldığında uzun süreli hipoksik hücrelerin normoksik kontrol hücrelere benzer miktarda mitokondriyal depolarizasyon cevabı oluşturduğunu göstermektedir (Şekil1a, 1b). HL-1 hücrelerinde uzun süreli hipoksiye rağmen hücrelerin akut oksijensizliğe yanıt oluşturabilmesi, uzun süreli hipoksi sonrası reoksijenasyonun ψ’nin hızlıca (30 dakikadan az) normoksik kontrol bazal değerlerine (polarize olduğunu) geri döndüğünü göstermektedir. Bu bulgular uzun süreli hipoksiden sonra mitokondrinin oksijenli solunum kapasitesinde kalıcı bir değişiklik oluşturmadığını desteklemektedir. Ancak, daha önceki sonuçlarımıza göre 48 saatlik hipoksi sonrası 2 saatlik reoksijenasyon ile azalan hücre içi ATP miktarının yerine konmaması (12), oksijenli solunumun tekrar başlamasının boşalan ATP havuzunu yenileyemediğini göstermektedir. Bu sonuç, uzun süreli hipoksi sırasında HL-1 hücrelerinde 48 saat hipoksi ve reoksijenasyon sonrasında, ATP üretim yolağında az verimli glikolizin ön plana çıktığını ya da ATP kullanımında artış olabileceğini düşündürmektedir. Ancak bu çalışmada, glikoliz yolağında görev alan ana enzimlerden biri olan GADPH miktarında bir değişiklik görülmemesi (Şekil 2a, 2b), hücrelerin kalıcı şekilde glikolitik yolağı tercih ettikleri yönünde yorum yapılmasını güçleştirmektedir. Benzer şekilde, daha önce yapılmış diğer çalışmalarda 48 saat hipoksi ya da normokside hipoksi ile indüklenen faktör (hif) yıkımını önleyen dimetil oksoglutarat ile inkübasyonunun hücresel ATP miktarını, uzun süreli hipoksi gibi, %60 oranında azalttığı bildirilmiştir (17). Bu sonuçlar hif’in ATP döngüsü üzerinde etkili olabileceğini öne sürmektedir. Bu bulgular, fare yetişkin kardiyomiyositlerinde akut hipoksi (PO2 <0,2 mmHg) sırasında KATP kanal aktivitesi ölçülerek saptanan ATP seviyesindeki azalmanın, reoksijenasyon ile yerine konduğu bildiren çalışmalar ile paralellik göstermemektedir (18). Bu farklılık, akut ve uzun süreli hipokside ayrı mekanizmaların ön planda olduğunu düşündürmektedir.

Bu çalışmadaki bulgularımız, uzun süreli hipoksi ile mitokondri membran potansiyeli değişikliklerinden bağımsız ve geri dönüşümsüz (ya da çok yavaş geri dönüşümlü) mitokondri disfonksiyonu olduğunu işaret etmektedir. Mitokondri membran potansiyeli oluşturan mitokondriyal H⁺ gradienti ve ATP üretimi arasındaki eşleşmenin belirgin olarak kaybolması, mitokondrinin reoksijenasyon sırasında ROS üretim yolağına kaydığını düşündürmektedir (19,20). Bu hipotez ile uyumlu olarak mitokondri potansiyelinin akut oksijen süpürülmesine yanıtı 48 saat hipoksik hücrelerde %30 oranında daha yavaştı (Şekil 1c). Bu durum, normoksik kontrollerine göre, 48 saatlik hipoksik hücrelerde elektron transport zincirindeki akımın kalıcı olarak yavaşladığını düşündürmektedir. Bu etki daha önceki çalışmalarda bildirilen iskemi reperfüzyon hasarındaki fonksiyonu bozulan mitokondriyal kompleksler ile ilgili olabilir (21,22). 48 saat hipoksik ve normoksik kontrol hücrelerdeki kararlı durum mitokondriyal membran potansiyelindeki benzerlik, azalan mitokondriyal elektron transportuna (membran potansiyelinde az polarizasyon) karşılık azalan ATP üretimi (membran potansiyelinde az depolarizasyon) arasındaki rastgele bir denge yüzünden gerçekleşmiş olabilir. Dolayısı ile, bulgularımız uzun dönem hipoksiden sonra elektron transport zinciri akımında hif aracılı ve kalıcı bir disfonksiyon olasılığını işaret etmektedir.

Deneylerimizde, normoksik kontrol ve 48 saat hipoksi gruplarının bazal ROS miktarları karşılaştırılmasında ratiometrik olmayan (non-ratiometrik) ROS boyası kullanılmıştır. Non-ratiometrik boya kullanıldığında gruplar arası farklar, hücrelerden boya kaybı gibi sebeplere bağlı olabileceğinden kıyaslama yapmak oldukça zordur. Ancak, deney grupları arasındaki bazal ROS sinyali ve H2O2’ye olan yanıtlarının birbirine zıt olması (toplu sonuçlar için bkz. Tablo 1), sonuçlar değerlendirilirken ROS boyasının bu dezavantajını büyük ölçüde ortadan kaldırmaktadır. Normoksik grupta gözlenen H2O2 yanıtının hipokside olmaması, hipoksi grubuna özgü boya kaybını düşündürürken aynı zamanda hipoksi grubunda bazal ROS sinyalinin normoksi grubuna göre yüksek olması bu olasılığı azaltmaktadır. Dolayısı ile, hipoksi ve/veya reoksijenasyon sırasında üretilen ROS’nin CM-DCFDA boyasında maksimum floresan sinyali (doygunluk) oluşturduğunu ve üzerine daha fazla H2O2 yanıtının alınamadığını düşündürmektedir. Tüm bu sonuçlar, 48 saat hipoksi sonrası kontrole göre bazal ROS sinyalindeki artıştan (Şekil 3a, 3b) mitokondrinin sorumlu olabileceğini işaret eder. Ancak, hücre sitoplazmasında mitokondri dışında da ROS oluşturabilecek bölgeler (plazma membranında NADPH oksidaz veya sitoplazmada bulunan ksantin oksidaz ya da lizozom, endoplazmik retikulum gibi organeller) bulunmaktadır (23). HL-1 hücrelerinde uzun süreli hipoksi ile indüklenen ROS artışında mitokondri dışındaki kaynakların da etkisi olabilir.

Sonuç

Kardiyak HL-1 hücrelerinde uzun süreli hipoksi, mitokondrinin oksijenli solunum kapasitesini değiştirmemekte ancak oksidatif fosforilasyon eşleşmesini bozduğu için kalıcı disfonksiyona sebep olmaktadır. Hipokside bozulan oksidatif fosforilasyon eşleşmesinin mitokondriyal ROS üretimine kayma olasılığı (akut anoksideki depolarizasyon yanıtının normoksik kontrollere göre yavaş olması, Şekil 1c) hücre sitoplazmasındaki bazal ROS miktarında artışın ana kaynağı olabilir. Bu çalışma ile ilk defa, kardiyak hücrelerde uzun süreli hipoksi ile indüklenen hücre içi ROS artışından mitokondrinin sorumlu olabileceği öne sürülmüştür. İzole memeli kardiyomiyosit primer hücre kültürü uzun sürede hücre canlılığı gibi problemler ortaya çıkartmaktadır. Bu sebeple, kardiyak HL-1 hücreleri kalpte uzun süreli hipoksinin etkisini araştırmak için iyi bir modeldir. Hipoksik ROS oluşumuna yol açan mekanizmaların ve ROS sinyalinin efektör alt yolaklarının aydınlatılması, kardiyak hücrelerin hipoksiye olan yanıtlarının anlaşılmasında ve dolayısı ile kardiyak iskemi/reperfüzyon veya ateroskleroz gibi patofizyolojilere karşı tedavi stratejilerinin oluşturulmasında kritik önem taşımaktadır.

Etik

Etik Kurul Onayı: Etik kurul onayı alınmamıştır.

Hasta Onayı: Hasta onayı alınmamıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

Yazarlık Katkıları

Konsept: G.Ş., H.B.K., Dizayn: G.Ş., H.B.K., Veri Toplama veya İşleme: G.Ş., H.B.K., Analiz veya Yorumlama: G.Ş., H.B.K., Literatür Arama: G.Ş., H.B.K., Yazan: G.Ş., H.B.K.

Çıkar Çatışması: Yazarlar tarafından çıkar çatışması yoktur.

Finansal Destek: Bu proje Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi (H.B. Kandilci, 17B0230001) tarafından desteklenmiştir.

References

Liu B, Tewari AK, Zhang L, et al. Proteomicanalysis of protein tyrosine nitration afteri schemiareperfusio ninjury:mitochondria as themajortarget. Biochim Biophys Acta 2009;1794:476-485.

Solaini G, Harris DA. Biochemicaldysfunction in heart mitochondria exposed to ischaemia and reperfusion. Biochem J. 2005;390:377-394.

Semenza GL.Hypoxia-induciblefactor 1: masterregulator of O2 homeostasis. CurrOpinGenet Dev. 1998;8:588-594.

Semenza GL, Roth PH, Fang HM, et al. Transcriptional regulation of genesencoding glycolytic enzymes by hypoxia-induciblefactor 1. J BiolChem 1994;269:23757-23763.

Semenza GL, Jiang BH, Leung SW, et al. Hypoxia response elements in thealdolase A, enolase 1, andlactatedehydrogenase A gene promoterscontain essential binding sitesfor hypoxia-inducible factor 1.J BiolChem 1996;271:32529-32537.

Ebert BL, Firth JD, Ratcliffe PJ. Hypoxia and mitochondrial inhibitorsregulate expression of glucose transporter-1 viadistinctCis-actingsequences. J Biol Chem 1995;270:29083-29089.

Turrens JF. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol 2003;552:335-344.

Papandreou I, Cairns RA, Fontana L, et al. HIF-1 mediates adaptation to hypoxia by actively downregulating mitochondrial oxygen consumption. Cell Metab. 2006;3:187-197.

Chandel NS, McClintock DS, Feliciano CE, et al. Reactive oxygen species generated at mitochondrial Complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: a mechanism of O2 sensing. J Biol Chem. 2000;275:25130-25138.

Chandel NS, Maltepe E, Goldwasser E, et al. Mitochondrial reactive oxygen species trigger hypoxia-induced transcription. Proc Natl Acad Sci. 1998;95:11715-11720.

Baracca A, Chiaradonna F, Sgarbi G, et al. Mitochondrial Complex I decrease is responsible for bioenergetic dysfunction in K-ras transformed cells. Biochim Biophys Acta 2010;1797:314-323.

Şimşek G, Vaughan-Jones RD, Swietach P, et al. Recovery from hypoxia-inducedinternalization of cardiacNa+/H+ exchanger 1 requires an adequate intracellular store of anti-oxidants. J Cell Physiol 2018.

Claycomb WC, Lanson NA, Stallworth BS, et al. HL‐1 cells: Acardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95:2979-2984.

Jezek P, Plecitá-Hlavatá L. Mitochondrial reticulum network dynamics in relation to oxidative stress, redox regulation, and hypoxia. Int J Biochem Cell Biol. 2009;41:1790-1804.

Skarka L, Ostadal B. Mitochondrial membra nepotential in cardiacmyocytes. Physiol Res 2002;51:425-434.

Halestrap AP, Pasdois P. The role of the mitochondrial permeabilitytransition pore in heartdisease. Biochim Biophys Acta. 2009;1787:1402-1415.

Sridharan V, Guichard J, Li CY, et al. O(2)-sensing signal cascade: clamping of O(2) respiration, reduced ATP utilization, and inducible fumarate respiration. Am J Physiol Cell Physiol. 2008;295:C29-37.

Ganitkevich V, Reil S, Schwethelm B, et al. Dynamic Responses of Single Cardiomyocytesto GradedIschemia Studiedby Oxygen Clamp in On-Chip Picochambers. Circ Res. 2006;99:165-171.

Chen Q, Moghaddas S, Hoppel CL, et al. Reversibleblockade of electron transport during ischemia protects mitochondria and decreases myocardial in jury followingreperfusion. J Pharmacol Exp Ther. 2006;319:1405-1412.

Chen CH, Budas GR, Churchill EN, et al. Activation of aldehyde dehydrogenase-2 reduces ischemic damag eto the hear. Science. 2008;321:1493-1495.

Lesnefsky EJ, Gudz TI, Migita CT, et al. Ischemic injury to mitochondrial electron transport in the aging heart: damage to the iron-sulfur protein subunit of electron transport complex III. Arch Biochem Biophys 2001;385:117-128.

Lesnefsky EJ, Slabe TJ, Stoll MS, et al. Myocardial ischemia selectively depletes cardiolipin in rabbit heart subsarcolemmal mitochondria. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001;280:H2770-2778.

Görlach A, Dimova EY, Petry A, et al. Reactive oxygen species, nutrition, hypoxia and diseases: Problems solved? Redox Biology. 2015;6:372-385.