The impact of cryopreservation with polyvinyl alcohol on the survival and functional activity of rat testis interstitial cells

Abstract

Aim. To investigate the impact of polyvinyl alcohol (PVA) in cryoprotective media on the survival and proliferation of rat testis interstitial cells (ICs) after cryopreservation. Methods. Rat ICs were obtained by enzymatic processing of testis with collagenase (type I) and DNase I. The obtained cells were cryopreserved by three methods. Methods 1 and 2 implied the use of cryoprotective medium (CM) based on 1.4 M dimethylsulfoxide (DMSO) and 10 % fetal cow serum (FCS) but utilized different cooling rates to –70°C. Method 1: ICs were cooled with 1°C/min. Method 2: after initiation of crystallization the cells were cooled with 15°C/min to –40°C and with 20°C/min from –40 to –70°C. Method 3 implied the cooling rate of 1°C/min but FCS was replaced by 20 mg/ml PVA. When the temperature –70°C was reached the samples were plunged into liquid nitrogen (–196°C). After warming and removal of CM the ICs were cultured in Ham’s/F12 with and without human chorionic gonadotropin (hCG). Results. The use of method 2 improved the survival of Leydig cells in samples to 79.5 (70.0; 90.0) % comparing with method 1 (42.0 (37.0; 47.0) %). The use of PVA in method 3 did not have an effect on ICs and Leydig cell survival comparing with method 1. Cell culturing showed that the number of Leydig cells in wells rose to 17 (0.09; 0.39) and 0.12 (0.08; 0.14) ×10⁶ after cryopreservation by method 2 and 3, respectively, when the cells were stimulated with hCG. These values are several times higher than the initial number of cells in the wells (0.65 (0.57;0.71) ×10⁴). Conclusion. PVA in combination with other components of cryoprotective medium promoted the survival of Leydig cells capable of further proliferation in culture, especially, in the presence of hCG.

Alternate abstract:

Мета. Вивчити вплив полівінілового спирту (ПВС) в кріозахисному середовищі на виживання і проліферацію інтерстиціальних клітин (ІК) сім’яників щурів після кріоконсервування. Методи. ІК отримували з сім’яників щурів ферментативним методом з використанням колагенази (тип I) і ДНКази I. Отримані клітини кріоконсервували за трьома методами. У методах 1 і 2 використовувалося кріозахисне середовище (КС) на основі 1,4 M диметилсульфоксиду (ДМСО) і 10 % фетальної телячої сироватки (ФТС), при цьому застосовувалися різні швидкості охолодження до -70 °C. Метод 1: ІК охолоджували зі швидкістю 1 °C/хв. Метод 2: після початку кристалізації клітини охолоджували зі швидкістю 15 °C/хв до –40 °C і зі швидкістю 20 °C/хв від –40 до –70 °C. Метод 3 передбачав швидкість охолодження 1 °C/хв, але ФТС була замінена на 20 мг/мл ПВС. При досягненні температури –70 °C зразки занурювали в рідкий азот (–196 °C). Після нагрівання і видалення кріозахисного середовища ІК культивували в середовищі Ham’s/F12 з хоріонічним гонадотропіном людини (ХГЛ) і без нього. Результати. Використання методу 2 дозволило підвищити виживаність клітин Лейдіга в зразках до 79,5 (70,0; 90,0)% в порівнянні з методом 1 (42,0 (37,0; 47,0)%). Використання ПВС в методі 3 не вплинуло на виживання ІК і клітин Лейдіга в порівнянні з методом 1. Культивування клітин показало, що кількість клітин Лейдіга в лунках збільшилася до 17 (0,09; 0,39) і 0,12 (0,08; 0,14) × 10⁶ після кріоконсервування за способами 2 і 3 відповідно, коли клітини стимулювали ХГЛ. Ці значення в кілька разів перевищують вихідну кількість клітин в лунках (0,65 (0,57; 0,71) × 10⁴). Висновок. ПВС в поєднанні з іншими компонентами кріозахисного середовища сприяв збереженню клітин Лейдіга, здатних до подальшої проліферації в культурі, особливо в присутності ХГЛ.

Alternate abstract:

Цель. Изучить влияние поливинилового спирта (ПВС) в криозащитных средах на выживаемость и пролиферацию интерстициальных клеток (ИК) семенников крыс после криоконсервирования. Методы. ИК получали из семенников крыс ферментативным методом с использованием коллагеназы (тип I) и ДНКазы I. Полученные клетки криоконсервировали тремя методами. В методах 1 и 2 использовалась криозащитная среда (КС) на основе 1,4 M диметилсульфоксида (ДМСО) и 10 % фетальной телячьей сыворотки (ФТС), при этом применялись различные скорости охлаждения до –70 °C. Метод 1: ИК охлаждали со скоростью 1 °C / мин. Метод 2: после начала кристаллизации клетки охлаждали со скоростью 15 °C/мин до –40 °C и со скоростью 20 °C/мин от –40 до –70 °C. Метод 3 предполагал скорость охлаждения 1 °C/мин, но ФТС была заменена на 20 мг/мл ПВС. При достижении температуры –70 °C образцы погружали в жидкий азот (–196 °C). После нагревания и удаления криозащитной среды ИК культивировали в среде Ham’s/F12 с хорионическим гонадотропином человека (ХГЧ) и без него. Результаты. Использование метода 2 позволило повысить выживаемость клеток Лейдига в образцах до 79,5 (70,0; 90,0)% по сравнению с методом 1 (42,0 (37,0; 47,0)%). Использование ПВС в методе 3 не повлияло на выживаемость ИК и клеток Лейдига по сравнению с методом 1. Культивирование клеток показало, что количество клеток Лейдига в лунках увеличилось до 17 (0,09; 0,39) и 0,12 (0,08; 0,14) ×10⁶ после криоконсервирования способами 2 и 3 соответственно, когда клетки стимулировали ХГЧ. Эти значения в несколько раз превышают исходное количество клеток в лунках (0,65 (0,57; 0,71) × 10⁴). Вывод. ПВС в сочетании с другими компонентами криозащитной среды способствовал сохранению клеток Лейдига, способных к дальнейшей пролиферации в культуре, особенно в присутствии ХГЧ.