大细胞神经内分泌肺癌（lung large-cell neuroendocrine carcinoma, L-LCNEC）于1991年由Travis等首次命名[1]，根据2015年世界卫生组织（World Health Organization, WHO）的分类标准，将LCNEC归为神经内分泌肿瘤，镜下特点包括肿瘤细胞大，细胞质丰富且多为嗜酸性，多形性明显，核仁明显，高有丝分裂率，常伴有坏死等[2]。LCNEC发病率低，在通过手术治疗的的肺癌患者中，L-LCNEC的发病率为2.1%-3.5%[3]。L-LCNEC恶性程度高，同时兼有神经内分泌肿瘤形态学分化特征及大细胞肺癌特性，具有较强的侵袭性，治疗效果较差[4]， 5年生存率在15%-57%之间[5]。因此在开始治疗前，如果可以预测患者预后，将对临床工作具有指导意义。
近年来研究[6-9]发现，血清乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）浓度与不同病理类型的肺癌患者预后相关，LDH水平升高会导致小细胞肺癌、肺腺癌患者预后不佳，但目前并没有研究指出LDH水平与L-LCNEC患者的预后是否相关。本研究旨在探讨手术前血清LDH浓度、手术前后LDH浓度变化趋势与L-LCNEC患者术后病情进展之间的关系，以期发现可以预测患者预后的指标。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本研究为回顾性分析，通过青岛大学附属医院病历系统，收集2014年1月-2019年12月在我院接受手术治疗的L-LCNEC患者。纳入标准：(1.)患者行“肺癌根治术+系统性淋巴结清扫术”，术后标本经病理学确诊为L-LCNEC；(2.)术前完善全身检查，未发现远处转移，术前分期为I期-IIIa期；(3.)病历资料完整。排除标准：(1.)具有其他恶性肿瘤病史；(2.)术后标本病理类型为复合型癌；(3.)合并肝功能不全的患者（谷丙转氨酶/谷草转氨酶（alanine aminotransferase/aspartate aminotransferase, ALT/AST）> 2.5倍正常值上限）；(4.)合并心肌梗死、脑梗死、肺栓塞等严重基础疾病；(5.)临床资料、随访信息不全。本研究已获得青岛大学附属医院伦理委员会批准。根据纳入及排除标准，最终共纳入L-LCNEC术后患者49例。
1.2 数据收集与随访
统计患者基本信息，包括性别、年龄、吸烟史、美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG）评分、疾病相关情况（包括肿瘤部位、类型、大小、淋巴结转移情况、术后分期、术前3天内的血清LDH浓度、术后2周内的血清LDH浓度、术后是否行放化疗）。
结局指标为患者的无病生存期（disease-free survival, DFS），定义为自确诊日期至疾病复发日期。随访方式包括查阅电子病历系统、电话随访，随访截止时间为2020年8月31日。
1.3 统计学方法
应用SPSS 25.0统计软件进行统计分析，绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线，用于计算手术前LDH的最佳临界值。使用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线，并通过对数秩检验进行比较。应用Cox比例风险模型寻找影响预后的因素，进行单因素、多因素分析，以明确独立预后因素。以P< 005为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 临床特征
本研究纳入49例患者，男性45例（91.84%），女性4例（8.16%）；< 6岁21例（42.86%），≥60岁28例（57.14%）；38例（77.55%）有吸烟史，11例（22.45%）无吸烟史；38例（77.55%）ECOG 0分，11例（22.45%）ECOG 1分；36例（73.47%）肿瘤位于右肺，13例（26.53%）肿瘤位于左肺；38例（77.55%）为周围型肺癌，11例（22.45%）为中央型肺癌；T分期：T1-T4分别为21例（42.86%）、17例（34.69%）、7例（14.29%）、4例（8.16%）；N分期：N0-2分别为29例（59.18%）、14例（28.57%）、6例（12.25%）；术后病理分期：Ia期14例（28.57%），Ib期7例（14.29%）；IIa期2例（4.08%），IIb期14例（28.57%），IIIa期12例（24.49%）；25例（51.02%）术后未接受化疗，8例（16.33%）术后接受“Pemetrexed (P)/Taxol (T)/Gemcitabine (G)+铂”方案化疗，16例（32.65%）术后接受“Etoposide (E)/Irinotecan (I)+铂”方案化疗；所有患者中，仅有2例术后行放射治疗，遂本研究未分析放疗对患者预后的影响。34例（69.39%）在随访过程中发现复发或转移，部分患者同时出现复发及转移，其中12例（35.29%）患者出现原发灶复发，26例（76.47%）出现远处转移，转移部位包括淋巴结（颈部、锁骨上、纵隔）16例（47.06%）、肝8例（23.53%）、肾上腺8例（23.53%）、骨6例（17.65%）和脑5例（14.71%）（表1）。
2.2 ROC曲线及生存曲线
对患者术后复查影像学结果进行随访，截止到最终随访日期，以是否出现复发或转移为分组标准，将患者分为稳定组与进展组。绘制ROC曲线时，连续变量为术前患者血清LDH浓度，二变量为病情是否进展。通过ROC曲线，可以得到最大约登指数，以此来确定手术前血清LDH水平的最佳临界值。通过计算，手术前血清LDH水平的最佳临界值为195.5 U/L（敏感度：0.697；特异性：0.750），曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.749（95%CI: 0.608-0.891, P=0.005）（图1）。
将195.5 U/L作为临界值，22例患者（44.90%）LDH浓度低于临界值，定义为低LDH组，27例患者（55.10%）LDH水平高于或等于临界值，定义为高LDH组。根据分组，应用对数秩检验进行生存分析，并绘制Kaplan-Meier生存曲线图。结果显示，高LDH组（≥195.5 U/L）的生存曲线与低LDH组（< 15.5 U/L）的相比差异具有统计学意义（mDFS：14.07个月 vs 17.02个月，P< 0001）（图2）。
另外还统计了患者术后2周内的LDH水平，将其与术前浓度相比较，以浓度变化超过5%为有意义，根据浓度变化进行分组，将浓度升高的患者定义为升高组，浓度降低者定义为降低组。经统计，所有患者手术前后LDH浓度变化均超过5%，其中升高组21例（42.86%），降低组28例（57.14%），同样绘制生存曲线图。结果显示，升高组的生存曲线与降低组的相比差异具有统计学意义（mDFS：13.27个月 vs 17.25个月，P< 0001）（图3）。
2.3 单因素及多因素分析
对患者的临床资料进行单因素分析，结果表明，与患者DFS相关的因素有吸烟史（P=0.028）、ECOG评分（P=0.001）、T分期（P=0.016）、N分期（P< 0001）、术后分期（P< 0001）、术后化疗（P=0.012）、术前LDH浓度（P< 0001）与手术前后LDH变化趋势（P< 0001）（表2）。
将有统计学意义的单因素纳入多因素分析中，结果显示，临床分期（P=0.003）、术后化疗（P< 0001）、术前LDH浓度（P< 0001）与手术前后LDH变化趋势（P=0.037）是患者术后DFS的独立预后因素（表3）。
Enlarge this image.图 1 L-LCNEC患者手术前血清LDH浓度的ROC曲线 Fig 1 ROC curve of serum LDH concentration before surgery in L-LCNEC patients. L-LCNEC: lung large-cell neuroendocrine carcinoma; ROC: receiver operating characteristic.
Enlarge this image.图 2 L-LCNEC患者手术前血清LDH水平与患者术后DFS的Kaplan-Meier生存曲线 Fig 2 Kaplan-Meier survival curve of L-LCNEC patients with preoperative serum LDH levels and postoperative DFS. DFS: disease-free survival.
Enlarge this image.图 3 L-LCNEC患者手术前后血清LDH变化与患者术后DFS的Kaplan-Meier生存曲线 Fig 3 Kaplan-Meier survival curve of L-LCNEC patients' serum LDH changes before and after surgery and patients' postoperative DFS
3 讨论
L-LCNEC是一种起源于支气管及肺黏膜上皮的神经内分泌细胞的肿瘤[10]，1991年，Travis及其同事首次对其命名，将其描述为由大细胞组成的肿瘤，特征包括核质比低、核仁频繁、有丝分裂率高（每10个高倍视野中有10个以上的有丝分裂）和大量坏死[1]。2004年WHO将LCNEC归于大细胞癌的一种亚型[11,12]。2015年WHO将LCNEC归于肺神经内分泌癌范畴，诊断标准包括光镜下有神经内分泌形态的存在，高有丝分裂率，大于每10个高倍视野有10个有丝分裂，典型的坏死和至少一种神经内分泌标志物，如突触素、嗜铬粒蛋白A、神经细胞黏附分子CD56/NCAM的免疫组织化学表达阳性[3,13]。L-LCNEC发病率低，根据现有文献[3]，在切除的肺癌中，LCNEC的发病率在2.1%-3.5%之间。好发于吸烟男性，多呈周围型肺癌[14]，经统计，L-LCNEC手术量占我院肺癌手术总量的1%-2%。由于发病罕见，起病隐匿，侵袭能力强，临床诊断困难，现有的治疗策略多来自于临床试验研究。对于早期患者，手术治疗仍然是首选[14]。对于早期可切除的L-LCNEC，I期患者5年总生存率为68%-71%，II期为32%-89%，IIIa期为42%[15]，但容易出现远处复发转移[16]。因此在开始治疗前，如果可以预测患者预后，将对临床工作具有指导意义。
LDH是糖酵解和糖异生过程中的关键酶。催化丙酮酸和乳酸的相互转化，对能量代谢具有重要意义。LDH、缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1, HIF-1）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）等因素将肿瘤代谢与血管生成联系在一起，在LDH、HIF-1和VEGF调控作用下，肿瘤细胞迅速生长，使得病情进展[17-20]。有研究[6-9]表明，LDH水平升高，会导致小细胞肺癌、肺腺癌患者预后不佳。
在本研究中，我们通过ROC曲线，确定手术前LDH浓度的最佳临界值为195.5 U/L，以此为界将患者分为高低两组，绘制生存曲线，结果显示高组患者的中位DFS较低组缩短，差异具有统计学意义（14.07个月 vs 17.02个月，P< 0001），因此手术前高LDH水平与L-LCNEC患者术后DFS缩短有关。另外，通过比较手术前后LDH浓度变化趋势，我们发现，升高组的生存曲线与降低组的相比差异具有统计学意义（13.27个月 vs 17.25个月，P< 0001），因此术后LDH水平升高也与L-LCNEC患者术后DFS缩短有关。通过单因素、多因素分析显示，手术前LDH浓度、手术前后LDH变化趋势可能是L-LCNEC患者术后的独立危险因素（P< 0001, P=0.037），术前高浓度、术后浓度升高提示术后复发转移出现早，预后差。
这可能对L-LCNEC患者术后治疗提供新思路，是否可以通过降低LDH浓度，使患者生存获益。Yang等[21]的研究发现，草酸盐（一种LDH-A抑制剂）能显著抑制NSCLC细胞增殖，对正常肺上皮细胞的毒性要低得多。结果证实针对LDH-A的靶向治疗在NSCLC治疗中的潜在用途。这也进一步支持了靶向LDH在L-LCNEC患者中的治疗潜力。
Iyoda及其同事[22]研究发现，与单纯手术相比，术后辅助含铂化疗能显著降低患者的疾病复发率（P=0.016,8）。Sarkaria等[23]研究证实，Ib期-IIIa期患者术后接受含铂化疗，与单纯手术相比，中位总生存期明显延长（7.4年 vs 2年）。本研究结果发现，术后化疗也是L-LCNEC患者术后DFS的独立预后因素（P< 0001），这与上述结论相一致，因此术后化疗也是L-LCNEC患者术后重要的预后因素。
我们的研究存在一些局限性。第一，本研究为单中心研究，研究人群比较局限，且样本量较小；第二，本研究为回顾性研究，不能完全排除选择偏倚，信息偏倚；第三，不能完全排除与LDH相关的混杂因素，如饮食、生活习惯等。因此需要进一步开展大规模、多中心的前瞻性研究以证实我们的研究结果。
综上所述，L-LCNEC患者术前LDH浓度及其术后浓度变化是患者DFS的独立预后因素，术前高浓度、术后浓度升高会导致患者DFS缩短，预后差，应及早进行干预治疗。
Author contributions
Wang HC, Yang X and Yu Z conceived and designed the study. Wang HC analyzed the data. Wang HC, Shan DF and Dong Y contributed analysis tools. Wang HC, Yang X and Yu Z provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.
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