Contribution à l'étude des déterminants viraux influençant la pathogénicité des coronavirus bovins

Abstract

Depuis 1987, plusieurs isolats de coronavirus bovins ont été récupérés des contenus intestinaux de veaux diarrhéiques et de bovins adultes atteints de la dysenterie d'hiver provenant de fermes de 6 régions différentes du Québec. La présence du virus a été confirmée en microscopie électronique et par enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) . Les isolats ont été adaptés et propagés pour 3 à 5 passages sur cellules HRT-18 en présence de trypsine. Les souches de référence, ainsi que les différents isolats québécois, ont été purifiés par ultracentrifugation différentielle et isopycnique sur gradient de densité de saccharose. Les virus furent récupérés au niveau des fractions correspondant à des densités de flottation de 1.16 à 1.18 g/ml de saccharose. La présence de particules coronaviriformes a été confirmée en microscopie électronique après incubation en présence d'un antisérum dirigé contre la souche Mebus du coronavirus bovin et marquage à la protéine-A couplée à l'or colloïdal.

La propagation des virus sur les cellules HRT-18 a permis l'identification de trois groupes distincts selon le type d'effet cytopathogène (ECP) induit par ces derniers. Tous les isolats récupérés de cas de dysenterie d'hiver se sont avérés hautement fusogéniques. Pour mieux visualiser les différents types d'ECP en microscopie photonique, nous avons utilisé la technique d'immunoperoxidase indirecte. Lors d'épreuves d'hémagglutination (HA), tous les isolats de coronavirus bovin ainsi que le coronavirus TCV de la dinde, le coronavirus HEV porcin et le coronavirus respiratoire humain HCV-OC43 se sont avérés hémagglutinants lorsque testés contre des érythrocytes de rat. Les isolats associés à la dysentérie d'hiver étaient dépourvus de cette activité lorsque testés à 37°C, mais étaient comparables aux autres coronavirus bovins lorsque testés à 4°C. Les évaluations quantitatives de l'activité destructrice de récepteurs (RDE) ont permis de classer les isolats de coronavirus bovin en deux sous-groupes différents, cette activité étant plus élevée pour les isolats associés à la dysentérie d'hiver. En ce qui a trait à l'activité acétyl-estérase, aucune variation significative n'a pu être observée. Les analyses d'électrophorèse sur gels de polyacrylamide n'ont pas permis de révéler de différences majeures entre les isolats de BCV.

Pour les fins de comparaison sérologique, un antisérum hyperimmun produit chez le lapin contre la souche Mebus du coronavirus bovin ainsi que des anticorps monoclonaux (AcMo) dirigés contre les glycoprotéines S et HE du BCV, ont été utilisés. La réactivité des AcMo envers les isolats de BCV associés aux épisodes de diarrhée néonatale du veau a été analysée selon différentes épreuves sérologiques. Ces AcMo avaient été obtenus lors d'expériences de fusion réalisées à l 1aide de splénocytes de souris immunisées contre la souche de référence du Nébraska et les cellules myélomateuses Sp2/0 non-sécrétrices . Les tests d'inhibition de l'hémagglutination(IHA) ont permis l'identification de deux isolats se différenciant sérologiquement de la souche prototype. Les analyses des profils polypeptidiques par la technique d'immunobuvardage de même que les tests d'immunofluorescence et de séroneutralisation, à l'aide de l'antisérum polyclonal de référence, ont démontré que tous les isolats québécois de BCV partageaient des déterminants antigéniques au niveau de chacune de leurs protéines structurales.

Abstract (AI English translation)

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Since 1987, several bovine coronavirus isolates have been recovered from the intestinal contents of diarrheal calves and adult cattle with winter dysentery from farms in 6 different regions of Quebec. The presence of the virus was confirmed by electron microscopy and by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The isolates were adapted and propagated for 3 to 5 passages on HRT-18 cells in the presence of trypsin. The reference strains, as well as the various Quebec isolates, were purified by differential and isopycnic ultracentrifugation on a sucrose density gradient. The viruses were recovered at the level of the fractions corresponding to flotation densities of 1.16 to 1.18 g/ml of sucrose. The presence of coronaviriform particles was confirmed by electron microscopy after incubation in the presence of an antiserum directed against the Mebus strain of bovine coronavirus and labeling with protein-A coupled with colloidal gold.

The propagation of the viruses on the HRT-18 cells allowed the identification of three distinct groups according to the type of cytopathic effect (CPE) induced by the latter. All isolates recovered from winter dysentery cases were found to be highly fusogenic. To better visualize the different types of ECP in light microscopy, we used the indirect immunoperoxidase technique. In haemagglutination (HA) assays, all bovine coronavirus isolates as well as turkey TCV coronavirus, porcine HEV coronavirus, and human respiratory coronavirus HCV-OC43 were found to be hemagglutinating when tested against rat erythrocytes. Isolates associated with winter dysentery lacked this activity when tested at 37°C, but were comparable to other bovine coronaviruses when tested at 4°C. Quantitative assessments of receptor destructive activity (RDE) classified bovine coronavirus isolates into two different subgroups, with this activity being higher for isolates associated with winter dysentery. With regard to the acetyl-esterase activity, no significant variation could be observed. Polyacrylamide gel electrophoresis analyzes did not reveal any major differences between BCV isolates.

For the purposes of serological comparison, a hyperimmune antiserum produced in rabbits against the Mebus strain of bovine coronavirus as well as monoclonal antibodies (MoAb) directed against the S and HE glycoproteins of BCV were used. The reactivity of MoAbs towards BCV isolates associated with episodes of neonatal diarrhea in calves was analyzed according to different serological tests. These MoAbs had been obtained during fusion experiments carried out using splenocytes from mice immunized against the Nebraska reference strain and non-secretory Sp2/0 myeloma cells. Hemagglutination inhibition (IHA) tests identified two isolates that differed serologically from the prototype strain. The analyzes of the polypeptide profiles by the immunoblotting technique as well as the immunofluorescence and seroneutralization tests, using the reference polyclonal antiserum, demonstrated that all Quebec isolates of BCV shared antigenic determinants at the level of each of their structural proteins.