Le virus de la mosaïque du navet (TuMV) comme vecteur pour l’expression de protéines hétérodimériques

Abstract

Il est maintenant possible de convertir les plantes en usines naturelles de médicaments ou autres molécules à hautes valeurs ajoutées. L'agriculture moléculaire, ou moléculture, répond ainsi à une demande pressante. La variable critique pour la viabilité économique de cette approche est la rapidité avec laquelle une forte concentration de protéines d'intérêt est atteinte dans la plante. En combinant la capacité réplicative des virus et l'intégration stable d'un transgène dans la plante, il sera possible d'amplifier de manière très significative et ce, rapidement, la quantité de protéines estimées produites au moment de la récolte.

Le virus de la mosaYque du navet (TuMV) est membre du grand groupe des Potyvirus. Son génome est constitué d'une molécule d'ARN simple brin de polarité positive longue de 10 000 nucléotides. Le TuMV code pour une polyprotéine unique qui est clivée en 10 protéines matures par trois protéinases virales. Les caractéristiques importantes du TuMV qui en font un candidat de choix pour le développement d'un vecteur d'expression sont premièrement, qu'une protéine d'intérêt qui ferait partie de la polyprotéine serait synthétisée au même niveau que les autres protéines virales; deuxièmement, la forme filamenteuse du virus offre la possibilité d'introduire plus d'un gène étranger dans le même vecteur.

En utilisant une copie ADN du génome viral cloné sous le contrôle d'un promoteur constitutif, notre équipe a pu réaliser deux premières constructions contenant soit le gène rapporteur gfp ou uidA inséré entre les gènes codant pour les protéines P1 et HC-Pro du TuMV. Malgré que la libération de ces protéines de la polyprotéine virale générait la présence d'acides aminés supplémentaires aux extrémités, les résultats des tests in planta ont révélé la production de GFP et de GUS fonctionnels.

Les objectifs de nos travaux visent donc à : 1) déterminer la possibilité d'exploiter un second site d'insertion, et 2) d'élaborer une stratégie nouvelle d'insertion qui permettrait la production de protéines aux extrémités carboxy­ terminales non-modifiées. Ainsi dans un premier temps, les gènes gfp ou uidA ont été insérés entre les gènes codant pour les protéines Pol et CP du virus. Des essais transitoires furent réalisés sur des plants de Brassica par la technique de biolistique. L'observation aux ultraviolets et des tests histochimiques ont révélés la présence in vivo des protéines GFP et GUS fonctionnelles. Des immunobuvardages de type western et des analyses par RT-PCR ont montré la bonne expression de chacune des protéines insérées et que la stabilité transcriptionnelle semble influencée par la taille, la nature et/ou la position du gène étranger.

Suite à ces résultats, nous avons donc dans un deuxième temps tenté l'expression simultanée des deux gènes rapporteurs insérés dans une même construction. La maintenance du caractère infectieux du vecteur et l'expression efficace des gènes introduits nous ont ensuite mené a tester la production d'anticorps par l'intermédiaire de notre vecteur. Finalement, des délétions furent réalisées par PCR au niveau de la capside virale. Ces mutations avaient pour but d'identifier les séquences cis nécessaires à la réplication du TuMV. Les constructions ADN délétées furent transfectées sur des protoplastes de Nicotiana benthamiana. Les résultats préliminaires ont semblé démontrer la possibilité d'éliminer la séquence codante entre le 3^e et le 263^e codon de la capside tout en conservant une capacité de réplication plus qu'intéressante pour les besoins encourus.

Abstract (AI English translation)

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It is now possible to convert plants into natural drug factories or other molecules with high added value. Molecular farming, or moleculture, thus responds to a pressing demand. The critical variable for the economic viability of this approach is the speed with which a high concentration of proteins of interest is reached in the plant. By combining the replicative capacity of viruses and the stable integration of a transgene into the plant, it will be possible to very significantly and rapidly increase the quantity of estimated proteins produced at the time of harvest.

Turnip mosaic virus (TuMV) is a member of the large group Potyviruses. Its genome consists of a single-stranded positive-sense RNA molecule 10,000 nucleotides long. TuMV encodes a single polyprotein that is cleaved into 10 mature proteins by three viral proteinases. The important characteristics of TuMV which make it a candidate of choice for the development of an expression vector are firstly, that a protein of interest which would be part of the polyprotein would be synthesized at the same level as the other viral proteins; second, the filamentous form of the virus offers the possibility of introducing more than one foreign gene into the same vector.

By using a DNA copy of the cloned viral genome under the control of a constitutive promoter, our team was able to produce two first constructs containing either the gfp or uidA reporter gene inserted between the genes coding for the P1 and HC-Pro proteins of TuMV. Although the release of these proteins from the viral polyprotein generated the presence of additional amino acids at the ends, the results of the in planta tests revealed the production of functional GFP and GUS.

The objectives of our work are therefore aimed at: 1) determining the possibility of exploiting a second insertion site, and 2) developing a new insertion strategy that would allow the production of proteins with unmodified carboxy terminal ends. Thus, initially, the gfp or uidA genes were inserted between the genes coding for the Pol and CP proteins of the virus. Transient tests were carried out on Brassica plants using the biolistic technique. Ultraviolet observation and histochemical tests revealed the presence in vivo of functional GFP and GUS proteins. Western type immunoblots and RT-PCR analyzes showed the correct expression of each of the inserted proteins and that the transcriptional stability seems to be influenced by the size, nature and/or position of the foreign gene.

Following these results, we therefore subsequently attempted the simultaneous expression of the two reporter genes inserted in the same construct. The maintenance of the infectivity of the vector and the efficient expression of the introduced genes then led us to test the production of antibodies through our vector. Finally, deletions were made by PCR at the level of the viral capsid. These mutations were intended to identify the cis sequences necessary for the replication of TuMV. The deleted DNA constructs were transfected onto Nicotiana benthamiana protoplasts. The preliminary results seemed to demonstrate the possibility of eliminating the coding sequence between the 3rd and the 263rd codon of the capsid while retaining a more than interesting replication capacity for the needs incurred.