EFECTOS DEL CLORURO DE MERCURIO (HgCl^sub 2^) SOBRE LA SOBREVIVENCIA Y CRECIMIENTO DE RENACUAJOS DE DENDROSOPHUS BOGERTI/EFFECTS OF MERCURY CHLORIDE (HGCL^sub 2^) ON THE SURVIVAL AND GROWTH OF TADPOLES OF DENDROSPHUS BOGERTI

Abstract

Frog larvae were exposed to five lethal (0.25, 0.3, 0.36, 0.43, and 0.51 mg/l) and four sublethal concentrations (0.02, 0.04, 0.08, and 0.10 mg/l) of mercury chloride, in order to determine the LC^sub 50^ and effects on growth and development rates. The LC^ub 50^ at 96 h of HgCl^sub 2^ was 0.41 mg/l. There was evidence for an effect of Hg on growth (weight and length) at 10 and 20 days of exposure to 0.04, 0.08, and 0.1 mg/l HgCl^sub 2^ with a P < 0.001. In contrast, weight and length of tadpoles exposed to 0.02 mg/l HgCl^sub 2^ showed no significant differences with the negative control (P = 0.77 and P = 0.1, respectively). The highest growth inhibition was observed at 30 days. The time to reach Gosner stage 36 was significantly different in all specimens treated, with Hg compared to controls (H = 35.4, P < 0.001). The species D. bogerti is sensitive to mercury exposure in aquatic environments, with adverse effects on growth and development rate.

Headnote

Resumen

Larvas de la rana (Dendrosophus bogerti) fueron expuestas a cinco concentraciones letales (0,25, 0,3, 0,36, 0,43 y 0,51 mg/l) y cuatro subletales (0,02, 0,04, 0,08 y 0,10 mg/l) de cloruro de mercurio (HgCL 2) , con el fin de determinar la CL50, los efectos sobre el crecimiento y sobre la tasa de desarrollo. La CL50 96 h del HgCl2 fue 0,41 mg/l. Se evidenció un efecto del Hg sobre el crecimiento (peso y longitud) a los 10 y 20 días de exposición a 0,04, 0,08 y 0,1 mg/l HgCl2 con un P < 0,001. En contraste, el peso y la longitud de los renacuajos expuestos a 0,02 mg/l HgCl2 no mostraron diferencias significativas con el control negativo (P = 0,77 y P = 0,1, respectivamente). La mayor inhibición del crecimiento se observó a los 30 días (P < 0,001). En el tiempo para alcanzar el estadio 36 de Gosner se encontraron diferencias significativas en todos los ejemplares tratados con Hg con respecto al control (H = 35,4, P < 0,001). El retraso en el desarrollo puede estar relacionado con la alteración enzimática y en la naturaleza presenta consecuencias negativas en la sobrevivencia de los renacuajos debido a la rápida desecación de las charcas temporales y vulnerabilidad a depredadores. La especie D. bogerti es sensible a la exposición del mercurio en ambientes acuáticos, con efectos desfavorables sobre el crecimiento y la tasa de desarrollo.

Palabras clave: cloruro de mercurio, crecimiento, Dendrosophus bogerti, metamorfosis, renacuajos

Abstract

Frog larvae (Dendrosophus bogerti) were exposed to five lethal (0.25, 0.3, 0.36, 0.43, and 0.51 mg/l) and four sublethal concentrations (0.02, 0.04, 0.08, and 0.10 mg/l) of mercury chloride (HgCl^sub 2^), in order to determine the LC^sub 50^ and effects on growth and development rates. The LC^sub 50^ at 96 h of HgCl^sub 2^ was 0.41 mg/l. There was evidence for an effect of Hg on growth (weight and length) at 10 and 20 days of exposure to 0.04, 0.08, and 0.1 mg/l HgCl^sub 2^ with a P < 0.001. In contrast, weight and length of tadpoles exposed to 0.02 mg/l HgCl^sub 2^ showed no significant differences with the negative control (P = 0.77 and P = 0.1, respectively). The highest growth inhibition was observed at 30 days (P < 0.001). The time to reach Gosner stage 36 was significantly different in all specimens treated with Hg compared to controls (H = 35.4, P < 0.001). The delay in development may be related to an enzymatic alteration and in nature may have a negative impact on the survival of tadpoles due to rapid drying of temporary ponds and increased vulnerability to predators. The species D. bogerti is sensitive to mercury exposure in aquatic environments, with adverse effects on growth and development rate.

Key words: Dendrosophus bogerti, growth, mercuric chloride, metamorphosis, tadpoles

INTRODUCCIÓN

Entre las posibles causas del descenso de las poblaciones de anfibios en el mundo se señalan la alteración o destrucción de los hábitats naturales, la introducción de especies exóticas, las enfermedades infecciosas, la radiación ultravioleta, el calentamiento global y la pre- sencia de sustancias químicas en el ambiente (Christin et al. 2004, Collins y Storfer, 2003, Hayes et al. 2002, Rouhani et al. 2005).

La minería artesanal del oro en Colombia, ha favorecido el enriquecimiento de los ecosiste- mas acuáticos con mercurio (Hg) (Marrugo et al. 2008). Se calcula que por cada kilogramo de oro, al menos 1,32 kg de Hg son vertidos al ambiente, ya que para amalgamar el oro se usa una relación Hg/Au hasta 6:1 y en algunos casos 10:1 (Malm et al. 1990). No obstante, en áreas alejadas de las actividades mineras se ha estimado bajas concentraciones de Hg en el agua entre 0 y 0,003 mg/l (Marrugo y Lans 2006).

Por su naturaleza el Hg presenta alta persistencia en el ambiente, se bioacumula y biomagnifica y actúa como un disruptor endocrino en muy bajas concentraciones. El ingreso de Hg a los anuros ocurre a través de la superficie del cuerpo por absorción directa desde el agua, consumo de sedimento, absorción del aire durante la respiración y a través de la cadena alimenticia (Albrecht et al. 2007, Bulog et al. 2002, Burger y Snodgrass 2001, Lefcort et al. 1998, Sparling et al. 2006).

El Hg inhibe o estimula algunas enzimas y se acumula, conjuntamente con otros cationes esenciales para el organismo en los lisosomas (Loumbourdis y Danscher 2008). Debido a su alta afinidad por los grupos sulfhidrilos (SH) este metal inhibe los puentes disulfuros y causa un cambio en la estructura y función de las pro- teínas (Bridges y Zalups 2005, Loumbourdis y Danscher 2008). En larvas de anfibios expuestos a Hg, se han identificado malformaciones (Unrine et al. 2005), efectos negativos sobre la sobrevi- vencia, crecimiento y metamorfosis (Unrine et al. 2004, 2005, Unrine y Jagoe 2004), cambios en el comportamiento (Lefcort et al. 1998) y alteraciones en el sistema enzimático (Loum- bourdis y Danscher 2008).

Aunque Colombia es el segundo país más rico en anfibios y estos organismos son considerados excelentes indicadores de la calidad del ambiente por la amplia variedad de respuestas a sustancias contaminantes (Unrine et al. 2005, 2007), las investigaciones en este tema en nuestro país son aún incipientes. Por lo anterior, el trabajo busca determinar los efectos letales y subletales del Hg en larvas de Dendrosophus bogerti.

MATERIALES Y MÉTODOS

El cloruro de mercurio (HgCl2) es una sal soluble en el agua, de peso molecular 271,52, punto de fusión 276 °C y punto de ebullición 303 °C (Palacio et al. 2002). El HgCl2, es muy tóxico para los organismos acuáticos y es em- pleado en la industria agrícola como fungicida e insecticida.

La especie Dendrosophus bogerti es una rana endémica de Antioquia (Colombia) ampliamen- te distribuida en el Valle de Aburrá, habita entre 1.250 y 2.580 msnm, se reproduce en charcas temporales de zonas intervenidas (Palacio et al. 2006) y su desarrollo larval oscila entre 40 y 60 días bajo condiciones de laboratorio. El rápido desarrollo larval, la alta adaptabilidad de los renacuajos a condiciones del laboratorio y el alto número de neonatos por nidada (aproximadamente, 300), posibili- tan el empleo de renacuajos de esta especie en ensayos de toxicidad aguda y crónica (Gallo et al. 2006).

Se emplearon larvas de una sola nidada de D. bogerti, procedentes de una charca temporal en la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universi- dad de Antioquia, Medellín (Antioquia). La masa de huevos fue colectada al inicio del período de lluvias (mayo-junio) y fue trasportada en reci- pientes plásticos al laboratorio del grupo GAIA de la Universidad de Antioquia.

Los huevos fueron depositados en recipientes plás- ticos con agua proveniente de la charca, el agua fue reemplazada paulatinamente con agua potable filtrada, declorada y aireada hasta la eclosión. Los neonatos fueron aclimatados en acuarios de vidrio de 500 ml con agua reconstituida semidura durante cuatro días para ensayos de toxicidad aguda y siete días para ensayos crónicos. Durante la aclimata- ción y exposición de los renacuajos al HgCl2, la temperatura varió entre 19 a 21 °C y el fotoperíodo fue 14:10 horas luz:oscuridad. Los promedios de las variables fisicoquímicas fueron 7,27 para el pH, 60 mg/l de CaCO3 de dureza, 116 mg/l de alcalinidad y la concentración media de oxígeno disuelto fue 6,4 mg/l. La concentración de la solución stock empleada para los ensayos crónicos y agudos fue de 0,1 mg/l con el 98% de pureza y los renacuajos fueron alimentados con TetraMin ad libitum.

Renacuajos del estadio 26 de Gosner (1960) se expusieron a cinco concentraciones de HgCl2 (0,25, 0,3, 0,36, 0,43 y 0,51 mg/l) y un control con agua de dilución durante 96 horas sin alimentación (Esclapés 1999, Reish y Oshida 1987). En cada tratamiento se emplearon cinco réplicas en 500 ml de solución y 30 renacuajos. El recambio de la solución y la cuantificación de ejemplares muertos se hizo cada 24 horas (Esclapés 1999).

A partir de los resultados de las pruebas de toxi- cidad aguda, se definieron las concentraciones de HgCl2 (0,02, 0,04, 0,08 y 0,1 mg/l) y un control con agua de dilución para las pruebas crónicas. Para cada tratamiento, se emplearon 10 réplicas de dos larvas que se encontraban en estadio 26 (Gosner 1960).

Cada renacuajo se pesó a los 10, 20 y 30 días con una balanza electrónica ANAMER m- 300 de 0,001 g de precisión y se midió la longitud to- tal con un calibrador electrónico de ± 0,1 mm de precisión. La solución se renovó cada 48 horas y después de cada recambio se suministró TetraMin ad libitum. Adicionalmente, se registró el tiempo en que cada renacuajo alcanzó el estadio 36 (Gosner 1960) o momento de emergencia de las extremidades posteriores. En la prueba de toxi- cidad crónica se siguieron los procedimientos establecidos por Rowe et al. (1996), Snodgrass et al. (2000), Sparling et al. (2006), Unrine y Jagoe (2004).

La Cl50 se determinó mediante el método Probit (Kalish 1990). Los resultados de toxi- cidad crónica, fueron evaluados previamente para determinar si cumplían los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas, me- diante las pruebas Shapiro-Wilk y de Bartlett, con P > 0,001 (Guisande et al. 2006). A los datos de peso transformados a [radical] y de longitud a X 2 se les aplicó un análisis de varianza de una vía (ANOVA) y un análisis de compara- ción múltiple de Dunnet. Posteriormente, se emplearon las pruebas de Kruskal-Wallis y U de Mann-Whitney, con el fin de establecer si existían diferencias significativas en la dura- ción del desarrollo de los renacuajos. Todos los análisis se realizaron con el programa estadístico SSPS.

RESULTADOS

Toxicidad aguda. En los neonatos tratados con HgCl2 se observó inmovilidad tem - poral, tendencia a permanecer en el fondo del recipiente y contracciones musculares espasmódicas. La mortalidad de los renacua- jos se incrementó con la concentración hasta alcanzar el 90% a 0,51 mg/l a las 96 h (figura 1). El valor de la CL50 durante 96 h fue 0,41 mg/l de HgCl2.

Toxicidad crónica. Como se infiere de la tabla 1, la sobrevivencia de las larvas de D. bogerti disminuyó paulatinamente con el aumento de la concentración de HgCl2 y alcanzó el 85% al final de los 30 días de exposición en la mayor concentración (0,1 mg/l HgCl2).

Los valores de P de la prueba exacta de Fis- her, superiores a 0,05, indican que no existen diferencias estadísticamente significativas en la sobrevivencia de renacuajos de D. bogerti tratados con HgCl2 y los del control.

En todos los tratamientos con HgCl2 los rena- cuajos experimentaron reducción en el peso y en la talla promedio, respecto al control. Mediante el análisis de varianza de una vía (ANOVA) se estableció que el peso de los renacuajos varió significativamente a los 10 (F = 9,89, P < 0,001), 20 (F = 12,42, P < 0,001) y 30 días (F = 31,50, P < 0,001) (figura 2). También el tamaño corporal de los renacuajos disminuyó significativamente con respecto a los ejemplares del control a los 10 (F = 10,51, P = P < 0,001), 20 (F = 17,98, P < 0,001) y 30 días de exposición (F = 43,35, P < 0,001) (figura 2).

De acuerdo con el análisis de Dunnet, a los 10 y 20 días de exposición el peso y la longitud de las larvas de D. bogerti expuestas a 0,02 mg/l HgCl2 no se diferenciaron significativamente del control. En contraste, los ejemplares de los otros tratamientos mostraron diferencias significativas en el peso y la longitud con el control a los 10 y 20 días. Por su parte, a los 30 días el peso y la longitud de las larvas en todos los tratamientos con HgCl2 presentaron diferencias significativas con el control (figura 2).

Tiempo de metamorfosis. Mientras el tiempo promedio de los renacuajos del control para alcanzar el estadio 36 de la metamorfosis fue 45,3 días (figura 3), la exposición de las larvas a HgCl2 significó notable incremento de este pe- ríodo con promedio de 82,2 días en los ejempla- res tratados con 0,1 mg/l HgCl2. De acuerdo con los resultados de la prueba de Kruskal-Wallis, existen diferencias significativas entre los tra- tamientos en el tiempo necesario para alcanzar el estadio 36 (H = 35,4, P < 0,001).

La prueba de Mann-Whitney mostró que el tiempo para alcanzar el estadio 36 en las larvas expuestas a los cuatro tratamientos con HgCl2 presentó diferencias significativas con el control (P < 0,001).

DISCUSIÓN

Este estudio es el primero en reportar a las larvas de D. bogerti como especie sensible al Hg ya que demostraron efectos subletales, además, de ser de amplia distribución en el Valle de Abu- rrá y nativa para el departamento de Antioquia (Palacio et al. 2006), puede considerarse de mucha utilidad para evaluar la calidad del agua e integridad del ecosistema debido a la posición intermedia en las cadenas alimentarias. Por otro lado, D. bogerti se caracteriza por ser una rana que habita áreas perturbadas, hecho que nos permite inferir su contacto con contaminantes en sus hábitats naturales, su reproducción en ambientes acuáticos temporales con numerosos huevos por puesta, entre otros, también, demos- tró una buena adaptabilidad de huevos y larvas a condiciones de laboratorio con un desarrollo larval relativamente corto. Por último, especies del género Dendrosophus han sido empleadas para evaluar los efectos de sustancias tóxicas (Albrecht et al. 2007, Brand et al. 2009, Britson y Threlkeld 1998).

El valor de la Cl50 de HgCl2 en renacuajos de D. bogerti (0,41 mg/l) indica que son más tolerantes al Hg que los renacuajos de Rana breviceps (0,207 mg/l), Rana pipens (0,0073 mg/l) y Bufo melanosticus (0,056 mg/l) (TFG 2006) para el mismo período de exposición.

En embriones de la rana Gastrophryne caroli- nensis Birge y Black (1980) y Fort et al. (2006) reportaron diferentes Cl50 para el níquel, pro- bablemente relacionadas con la variabilidad genética asociada al lugar de procedencia y al contacto de los renacuajos con el contaminante (Fort et al. 2006). Las posturas de D. bogerti fueron colectadas en la zona urbana de Medellín; probablemente la mayor tolerancia al Hg de esta especie esté relacionada por algún contacto de los adultos con el Hg en su ambiente natural.

La información sobre los efectos de xenobió- ticos en el crecimiento y tiempo de desarrollo de los renacuajos de anfibios tropicales es aún limitada. La mayoría de las investigaciones con el género Dendrosophus (D. chrysoscelis, D. versicolor, D. cinerea) han demostrado que los metales pesados son altamente tóxicos (Albrecht et al. 2007). Además, el mercurio reduce la longitud y la masa corporal de los renacuajos, incrementa el tiempo de desarrollo (Britson y Threlkeld 1998) y produce malfor- maciones (Brand et al. 2010).

La tasa de crecimiento de los renacuajos trata- dos con HgCl2 se redujo considerablemente, en especial en la mayor concentración (0,1 mg/l). La reducción de peso y longitud de los rena- cuajos podría estar asociada con el incremento del costo metabólico debido a los procesos de depuración y detoxificación celular, a la reduc- ción de la actividad de algunas enzimas (Valle y Ulmer 1972) y a la mayor demanda de síntesis de aminoácidos (Nishisaka 1994). De acuerdo con Rowe et al. (1998), las larvas de Rana ca- tesbeiana que habitan en aguas contaminadas con metales pesados experimentaron pérdida de peso, asociado a altos costos metabólicos.

Peterson et al. (2008) encontraron una reducción en el número de dientes en los estadios 25 al 37 de larvas de Rana sphenocephala sometidas a una mezcla de metales pesados. Esta situación contribuyó a una disminución en el crecimiento, al igual que en renacuajos de Rana catesbeiana (Rowe et al. 1996). Probablemente, la reducida ganancia de peso está asociada a la inapetencia como se ha observado en la trucha Oncorhynchus mykiss expuesta a una concentración subletal de cadmio (Mcgeer et al. 1999).

Los juveniles de gran tamaño tendrán alta proba- bilidad de sobrevivir a la primera reproducción (Collins 1979, Smith 1987, Wilbur y Collins 1973) y mayor éxito reproductivo (Klump y Gerhardt 1987, Sparling et al. 2006, Sullivan 1992, Unrine et al. 2004). El macho de D. bogerti es más pequeño que la hembra y una reducción adicional del tamaño podría significar también disminución del éxito reproductivo. Adicionalmente, hem- bras pequeñas tienen posturas reducidas (Bush et al. 1996, Cummins 1986, Kaplan y Salthe 1979, Semlitsch 1987) como se ha evidenciado en Rana sylvatica, Rana spenocephala y Pseudacris triseriata expuestas a Hg y otros metales (Berven 1990, Peterson et al. 2008, Smith 1987).

Durante la metamorfosis los anfibios son muy sensibles a la exposición a sustancias químicas, debido a que experimentan cambios compor- tamentales, morfológicos, fisiológicos y bioquímicos (Unrine et al. 2004). Aunque en todos los tratamientos de HgCl2 se evidenció retraso del desarrollo, en las mayores concen- traciones, el efecto fue muy marcado y pudo estar relacionado con la interferencia de esta sustancia sobre la tiroides (Facemire et al. 1995) estrechamente relacionada con el proceso de la metamorfosis (Balls et al. 1985, Fort et al. 2000) como se ha demostrado en peces (Bhattachar- ya et al. 1989), roedores (Sin y Teh 1992) y humanos (McGregor y Mason 1991).

En renacuajos expuestos a soluciones acuosas de Hg2+, Ray y Madhyastha (1987) observaron mayor sensibilidad durante los eventos impor- tantes en el desarrollo de la metamorfosis. De acuerdo con Unrine et al. (2004), la acumulación del Hg en el tejido de la cola de los renacuajos bloquea los puentes disulfuros de las proteínas y retrasa el tiempo de absorción en R. spheno- cephala. Es posible que el retraso de la emer- gencia de las patas posteriores en D. bogerti esté relacionado con esta situación.

El retraso en la tasa de desarrollo afecta la sobrevivencia de las larvas de anuros y es- pecialmente de las especies que cumplen sus estadios tempranos en aguas temporales como D. bogerti. Los renacuajos que experimentan metamorfosis tardías no sobrevivirán, debido a la desecación (Denver 1997, Sparling et al. 2006). Asimismo, los individuos con extensos períodos larvales son altamente vulnerables a depredadores (Babbitt y Tanner 1997, Le- fcort et al. 1998, Semlitsch y Gibbons 1988, Werner 1991).

Las larvas de D. bogerti expuestas al Hg demos- traron efectos subletales, su posición intermedia en las cadenas alimentarias, la producción de numerosos huevos por camada, la buena adap- tabilidad de huevos y larvas a condiciones de laboratorio y un desarrollo larval relativamente corto indican que esta rana podría considerarse para estudios ecotoxicológicos.

CONCLUSIONES

Nuestros resultados demuestran que una exposición crónica de renacuajos a concen- traciones superiores a 0,02 mg/l HgCL2 tiene efectos significativamente desfavorables sobre el crecimiento y la tasa de desarrollo con posibles consecuencias sobre el fitness de los organismos. Aunque los resultados de la concentración letal media de mercurio para D. bogerti indican menor sensibilidad con re- lación a otras especies de anfibios reportadas en la literatura, es vulnerable a la acción de contaminantes que son usados sin control en la minería e industrias.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos al Grupo de Investigación en Gestión y Modelación Ambiental (GAIA) por su apoyo económico, igualmente a sus integrantes por su colaboración en este estudio.

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