Effects of Alkaline Thermal Pretreatment to Cyanobacteria Anaerobic Digestion and Microcystins Degradation

Abstract

以蓝藻为原料的厌氧发酵生物转化效率差，产气量低，恰当的预处理工艺可以调整蓝藻特性，提升厌氧发酵的产气效率。本文研究碱法热处理耦联的预处理工艺对蓝藻降解效果的影响，采用旋转组合设计法，以蓝藻藻浆SCODcr为响应值，研究预处理3个主要参数变化对蓝藻细胞的分解效果。结果表明，三次多项式数学模型可以很好的拟合联合预处理工艺参数对蓝藻藻浆SCODcr的影响，模型的R²为0.983 9。验证试验表明：当NaOH处理浓度为3%、78℃处理5.6 h时，蓝藻藻浆SCODcr为5 446 mg·L^-1，是采用1% NaOH、40℃处理3 h，蓝藻藻浆SCODcr值（2 570 mg·L^-1）的2.12倍。厌氧发酵结果表明，经优化处理后的蓝藻藻浆产气率较对照提高了4.72倍，达425.4 mL·g^-1 VS。同时，研究发现经预处理的蓝藻厌氧发酵后，烘干的藻粉中不含MC-RR，MC-YR含量仅为0.58×10^-2 μg·kg^-1，可安全地用于制备复合有机肥。

Owing to the protection from cell wall, biological conversion efficiency of cyanobacteria is low in anaerobic fermentation. Appropriate pretreatments can adjust characteristics of cyanobacteria, and enhance the efficiency of anaerobic fermentation. In this paper, the pretreatment of heat treatment coupled with alkali method was studied. The effect of three main pretreatment parameters on the decomposition of cyanobacteria was studied by using the rotation combination design method (RCDM). The SCODcr was the response value of RCDM. The results showed that cubic polynomial mathematical model could be good fitting fluctuation of SCODcr in difference combined pretreatment process, the R² of the model was 0.983 9. The experimental verification display:3% NaOH, 78℃ heat treatment for 5.6 h, SCODcr of cyanobacteria was 5 446 mg·L^-1. While 1% NaOH,40℃ heat treatment for 3 h, SCODcr of cyanobacteria was 2 570 mg·L^-1. The effect of pretreatment on biogas production rate of anaerobic fermentation and degradation of microcystins were also detected. Compared with the control group, the optimized pretreatment cyanobacteria increased biogas yield of anaerobic fermentation by 4.72 times. The study also found that dry algae powder from anaerobic fermentation of pretreated cyanobacteria, did not contain MC-RR, and MC-YR content was 0.58×10^-2 μg·kg^-1, and therefore could be safely used in the preparation of organic fertilizer.

蓝藻水华严重危害我国水域环境生态健康。多数蓝藻细胞可产生蓝藻毒素，藻细胞死亡裂解后释放至水体中，威胁城市日常饮用水安全和公众健康^[1]。目前，应急打捞是我国减除蓝藻水污染生态灾害和降低再次暴发强度的最直接的有效措施^[2]。打捞出来的蓝藻藻浆不能直接被家禽、家畜食用，填埋或长期堆积在岸边，不仅无法有效利用丰富的蓝藻有机质，而且会产生藻毒素、多环芳烃等毒性物质，并伴随着具有臭味的硫化氢、氨气等有害气体释放^[3]。因此，如何绿色无污染地资源化利用被捞出的蓝藻藻浆成为亟待解决的问题。蓝藻有机质含量丰富，将其厌氧发酵制备沼气，厌氧发酵后的藻渣生产有机肥，真正做到物尽其用，具有非常广阔的应用前景。

蓝藻细胞壁含有果胶质和纤维素^[4]，且大多数蓝藻的细胞壁外面是胶鞘，蓝藻胶鞘的粘性多糖结构可阻碍蓝藻细胞被彻底分解^[5]。此外，未经事先破壁处理的蓝藻可与厌氧制气的微生物相互竞争营养，直接影响厌氧发酵的产气效率和产气量^[6]。目前，已有的研究报道了混合厌氧发酵对蓝藻厌氧发酵产气率的提高，或单相、两相厌氧生物反应器的选择和设计对厌氧发酵的影响，以及部分蓝藻发酵产酸的预处理研究^[6-9]，但有关蓝藻厌氧发酵制沼气的预处理工艺鲜有研究报道，因而未从根本上解决由蓝藻细胞壁引发的物料生物可降解性差的问题。

以微囊藻毒素（Microcystins, MCs）为主的蓝藻毒素化学性质极为稳定^[10]。自然水体中的MCs主要依赖于溶解性腐殖质及溶解性色素催化下的光降解来完成，一般需要15~40 d^[11-12]；打捞上岸的有毒蓝藻藻浆不但MCs含量高，且不易降解。目前，有关降解MCs的研究报道较多，主要集中于采用物理方式（如等离子体法^[13]）、化学方式（如纳米TiO2薄膜光催化光降解^[14]、紫外催化光降解等^[15]）及生物法（如微生物降解法，大多为Sphingomonas属细菌^[16]），但上述的研究结论均是基于实验生态学方法下纯化MCs降解效果而得出的，而关于规模地资源化利用蓝藻对MCs降解效果的研究仅见韩士群等^[2]在太湖蓝藻资源化利用的报道。蓝藻厌氧发酵后的藻渣作为有机肥生产的原料，但藻渣中MCs含量必须低于世界卫生组织公布的1 μg·kg^-1（或1 μg·L^-1）以下^[17]，否则极易造成农田MCs污染，进而威胁农产品的质量安全。

基于上述问题，本文以提升厌氧发酵工艺物料的生物可降解性及安全应用厌氧发酵后的藻渣为原则，研究了碱法热处理工艺对蓝藻降解效率的影响，并对比了优化处理和未处理的蓝藻藻浆厌氧发酵产沼气的效率，为增加蓝藻厌氧发酵制备沼气效率提供新的预处理工艺思路，同时分析了预处理工艺对厌氧发酵过程中两种典型MCs（MC-YR和MC-RR）^[18]降解效果的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验蓝藻收集自2015年8月天津海河二道闸水域，经200目筛绢网粗过滤，去除滤液作为预处理试验蓝藻藻浆物料，厌氧发酵的原始污泥取自天津滨海新区大港污水处理厂，经驯化后作为厌氧发酵制备沼气的接种污泥，试验蓝藻藻浆物料和接种污泥特征见表 1。

表 1 试验物料及接种物特征 Table 1 Physical and chemical properties of test cyanobacteria and inoculum

1.2 碱法热预处理及验证试验方案

采用旋转组合设计法（见表 2）研究碱法热预处理工艺中碱用量、热处理温度及处理时间3个主要参数变化对蓝藻细胞的分解效果。各预处理的蓝藻用量均为500 mL，蓝藻特征见表 1，碱处理因素中，NaOH用量是基于蓝藻鲜重基础之上的质量百分比。依据试验结果建立回归方程，结合曲面分析确定最优的预处理参数。根据优化的预处理参数进行预处理验证试验，并以预处理后蓝藻为底物，（35±2）℃进行厌氧发酵实验，厌氧发酵实验的底物有机负荷为7.2 g·L^-1 VS。厌氧发酵接种污泥与发酵料液的比为1:9（体积比）。

表 2 因素水平编码表 Table 2 Code factor levels

1.3 仪器装置

上海恒电热恒温培养箱DHP-9012；岛津SPD-M20A高效液相色谱；上海雷磁COD-572型化学需氧量测定仪；Sigma台式离心机；采用自制的序批式厌氧发酵装置和排水法收集气体装置。

1.4 测定指标及分析方法

1.4.1 预处理效果分析方法

碱法热预处理后的蓝藻物料经5 000 r·min^-1离心，取上清液经0.45 μm滤膜过滤，滤液参考GB/T 11914—1989测定CODcr，记为SCODcr值。采用Design-expert软件分析预处理的SCODcr值，进行三次多项式逐步回归拟合数学模型及统计学分析。

1.4.2 厌氧发酵产气率的计算

量取一定体积厌氧发酵底物在105~110 ℃烘干至恒重，600 ℃去除挥发性固体，采用差量法计算挥发性固体（VS）含量。采用排水法收集测定厌氧发酵产气量，计算厌氧发酵产气量与挥发性固体比值，记作单位挥发性固体的产气率。

1.4.3 藻毒素测定及含量计算

分别取4、8、12、16 μL和20 μL浓度为10.0 μg·mL^-1藻毒素YR和藻毒素RR进行高效液相色谱检测。根据藻毒素出峰面积，绘制出标准曲线。HPLC检测条件为：Shim-pack VP-ODS 250 mm×4.16 mm ZD色谱柱，柱温为40 ℃，流动相为60％色谱甲醇（0.05％体积比，TFA），流速为1 mL·min^-1，进样量20 μL，在波长238 nm下进行检测。

取发酵过程中的藻液，在-20、4 ℃条件下反复冻融5次，于10 000 r·min^-1、4 ℃下离心10 min，收集上清液；在离心后的藻泥沉淀中加入20～30 mL的5％乙酸，搅拌20 min后，于10 000 r·min^-1、4 ℃下离心10 min，收集上清液；然后在离心后的藻泥沉淀中加入80％色谱甲醇30 mL，溶解沉淀搅拌20 min，离心收集上清液后旋蒸（75 ℃）去除其中的甲醇；将3次收集到的上清液混合后过0.22 μm滤膜，以备进行固相萃取。

使用SPEC₁₈固相萃取小柱进行藻毒素的固相萃取，先用10 mL色谱级甲醇预先活化，再用15 mL纯水冲洗，然后开始上胞内提取上清液，过C₁₈小柱，流速控制在8~12 mL·min^-1内，然后用10 mL纯水冲洗，20％的色谱甲醇冲洗杂质，再用40 mL 60%甲醇（0.05％体积比，TFA）洗脱并收集，旋蒸浓缩蒸干，用1 mL 60％的甲醇溶解并收集，过0.22 μm滤膜去杂质后进行HPLC检测，根据已构建的标准曲线计算样品的藻毒素总量，另取等量的发酵藻液105~110 ℃烘干至恒重，依其重量计算样品中藻毒素的含量。

2 结果与分析

2.1 碱法热处理对蓝藻分解效果的影响

依据表 2设计的试验方案对蓝藻进行不同参数条件的碱法热处理，测定各试验组处理后蓝藻滤液的SCODcr值，结果见表 3。

表 3 碱法热处理各因素对蓝藻分解的影响 Table 3 Effect of alkaline thermal pretreatment to cyanobacteria degradation

预处理的实验结果说明（表 3），不同的碱含量、热处理温度和处理时间的组合对蓝藻滤液的SCODcr值影响有较大的差异，8号实验组的3.7%碱用量、60 ℃处理6 h，最有利于蓝藻分解，其SCODcr值为5 457 mg·L^-1，是18号实验组（2 570 mg·L^-1）的2.12倍，说明实验点的选取合理的反映了各预处理组因参数不同引起的检测指标存在明显差异。

2.2 预处理工艺数学模型的建立

依据表 3中碱法热处理试验结果，进行三次多项式逐步回归拟合，建立蓝藻溶出物SCODcr值对碱处理浓度、热处理温度以及联合处理时间的响应模型，模型的主要统计学指标见表 4，残差分析（图 1）符合统计学无规律波动特征，响应模式的公式为：

表 4 碱法热处理蓝藻数学模型的统计学指标 Table 4 Statistical index of the model of alkaline thermal pretreatment to cyanobacteria degradation

图 1 各试验组SCODcr的残差分析图 Figure 1 The residual analysis of SCODcr in test groups

式中：Y为蓝藻溶出物SCODcr响应值（mg·L^-1）；A为预处理中的碱含量（%）；B为热处理温度（℃）；C为联合预处理的时间（h）。

2.3 预处理工艺的参数优化

各处理因素水平对蓝藻SCODcr的影响结果见图 2。由图 2a可以看出，随碱用量的增加，蓝藻藻浆液相的SCODcr值持续增加。但在每个不同的碱浓度条件下，蓝藻藻浆的SCODcr值与处理时间仅在6 h内呈正相关，继续增加处理时间，SCODcr增加缓慢，这种现象在高浓度碱处理时更明显。图 2b显示，在高温（80 ℃）条件下，碱处理浓度增加时，蓝藻藻浆的SCODcr值从4 000 mg·L^-1增加至5 500 mg·L^-1，低温（40 ℃）热处理条件下，试验范围内的最高碱用量时，SCODcr值仅为4 500 mg·L^-1左右，明显低于80 ℃条件下的蓝藻滤液SCODcr值，而低温低碱条件下的蓝藻处理后的滤液SCODcr值低于4 000 mg·L^-1。根据三次多项式回归拟合模型求解的碱法热处理工艺优化参数及处理后蓝藻藻浆SCODcr预测值为：预处理可采用碱用量3%，控制温度78.2 ℃，处理时间5.64 h，藻浆SCODcr值为5 479 mg·L^-1。

图 2 碱法热处理工艺参数的标准化响应曲面图 Figure 2 The surface drawing of alkaline thermal pretreatment response surface model

2.4 预处理优化条件的验证实验

考虑实际操作的便利，选取3%的碱含量，78 ℃的处理温度，5.6 h的预处理参数对蓝藻处理3次，测得滤液SCODcr的均值为5 446 mg·L^-1。

2.5 蓝藻厌氧发酵制备沼气实验

采用优化后的碱法热处理工艺预处理蓝藻，得到的物料进行厌氧发酵试验，如图 3所示。预处理后的蓝藻物料厌氧反应没有迟缓期，前2 d的日产气量均大于35 mL·g^-1 VS，而未经预处理的蓝藻在厌氧发酵的第4 d才达到最大日产气高峰，为12.5 mL·g^-1 VS，仅为优化预处理条件下最大日产气量的35.3%。试验结束时，碱热预处理的蓝藻物料累积产气量为425.4 mL·g^-1 VS，是未处理蓝藻的4.72倍。预处理实验组的厌氧发酵前20 d产气率均高于5 mL·g^-1 VS，而未预处理实验组厌氧产气反应发生在前11 d。

图 3 碱法热处理和未经预处理的蓝藻厌氧发酵沼气产率 Figure 3 Anaerobic fermentation biogas yield of cyanobacteria treated and untreated

2.6 厌氧发酵过程中发酵液MCs含量的变化规律

如图 4a所示，采用高效液相色谱检测MC-RR和MC-YR标准样的回归方程分别为：Y_MC-RR=5 335.5X_MC-RR（R²=0.977 5）和Y_MC-YR=5 650.6X_MC-YR（R²=0.931 7）。

图 4 厌氧发酵过程中藻毒素含量的变化 Figure 4 Changes of microcystins in anaerobic fermentation

未经预处理和经过预处理的蓝藻在厌氧发酵阶段，MC-RR的含量降低均较快，高效液相色谱检测显示，厌氧发酵1 d和3 d后，两类发酵料液中均未检出MC-RR（见图 4b）。实验发现厌氧发酵过程中MC-YR比MC-RR更难降解。厌氧发酵初期，未经处理的蓝藻MC-YR增加。厌氧反应第7 d，未预处理的MC-YR含量最大，为10.6×10^-2 μg·kg^-1，此后，藻毒素含量逐渐下降，至厌氧发酵第21 d，藻毒素降至约2×10-2 μg·kg^-1。之后，直至厌氧反应结束，MC-YR含量基本不再下降。而经过预处理的蓝藻厌氧发酵过程中藻毒素YR呈逐渐减少的趋势。厌氧发酵结束时，反应器中的MC-YR降低到0.58×10-2 μg·kg^-1。

3 讨论

在前期的预试验中发现，不同的NaOH浓度和不同的热处理温度以及处理时间对蓝藻的细胞壁裂解效果存在差异。本文采用旋转组合设计实验（表 2）的目的是为了进一步研究碱法热处理工艺各因素共同作用对蓝藻降解的影响。表 3的实验结果表明，各因素不同水平的组合对蓝藻滤液的SCODcr值影响很大，最大值与最小值之间相差2.12倍，这说明本文旋转组合设计实验选取的实验点可以明显区分不同工艺参数对蓝藻降解的效率。王卿等^[19]在研究菊芋茎秆预处理过程中也发现不同的热碱含量对茎秆后续酶解效率有明显影响，这说明选择恰当的预处理工艺参数可以显著提高蓝藻细胞的分解效率，有利于后续厌氧发酵阶段厌氧微生物对底物利用。

依据表 3建立的回归数学模型失拟项>0.05（表 4），说明三次多项式基本考虑了可能的影响因子。调整拟合度（R_adj²）与预期拟合度（R_pre²）之差 <0.2，相对偏差（CV%） <10%，精密度（adequate precision）>4，R_adj²=0.983 9，残差分析图显示残差变化无规律性，这些统计学特征指标^[20]说明此三次多项式数学模型较好地解释预处理各因素水平对反应蓝藻降解效果指标SCODcr变化情况的影响，该数学模型可以用作碱法热处理蓝藻预处理工艺的分析与优化参数预测。

从碱法热处理参数的标准化响应曲面图可以看出，各因素之间存在一定的交互作用。图 2a显示的试验范围内碱用量与蓝藻滤液SCODcr变化趋势说明碱用量与蓝藻的分解情况成正相关性，这与高浓度的NaOH有利于蓝藻细胞壁纤维结构分解有关，朱圆圆等^[21]在研究碱法预处理对玉米秸秆结构的影响时也注意到NaOH可以实现脱乙酰基的作用；并且，在实验碱浓度条件下，蓝藻可能在6 h内已经分解完全。图 2b的实验结果表明随温度升高，碱法预处理可更有效破坏蓝藻细胞壁，使滤液的SCODcr值升高，说明热处理温度与碱之间存在促进蓝藻分解的正协同作用。

按照优化的工艺参数对蓝藻细胞进行预处理验证实验，所得结果低于旋转组合实验设计的第8组在3.7%碱用量，60 ℃条件下处理6 h得到的料液SCODcr为5 457 mg·L^-1，但这种差异可能源于实验误差。且与数学模型的预测结果偏差不到0.5%，说明建立的三次多项式模型对蓝藻的预处理工艺条件设置有很好的指导意义。

如图 3所示，预处理后的蓝藻厌氧发酵可以更快速地进入产气高峰，并且日产气率明显高于未经处理的蓝藻物料，这主要是因为处理后的蓝藻细胞裂解释放出更多的可溶性有机质供厌氧微生物利用转化沼气。同时，处理后的蓝藻细胞基本失去活性，在厌氧发酵初期不存在和厌氧微生物竞争生长的现象，有利于提高厌氧反应的效率。

蓝藻厌氧发酵制备沼气的对比实验结果也说明，预处理明显改善了蓝藻厌氧发酵物料的性质，使得厌氧发酵初期的物料效率增加，也使得厌氧发酵的累积产气率明显提升，国内外相关文献中也报道过对农业有机废弃物进行降解预处理可以提高厌氧发酵产气效率^[22-24]。预处理实验组有更长的产气周期，这可能与预处理后蓝藻细胞壁被破坏，物料可以被厌氧微生物更充分利用有关。

预处理和未预处理蓝藻厌氧发酵不同阶段的藻毒素对比变化结果表明（图 4b），MC-RR更容易降解，这可能是因为MC-RR的环肽结构更易被厌氧微生物分泌的酶降解。Park等^[25]在研究鞘氨醇单胞菌对藻毒素的降解时，也发现MC-RR比MC-YR有更快的降解速度。闫海等^[26]从云南滇池底泥中分离出的降解藻毒素的菌种Ralstonia solanacearum也对MC-RR有更快的分解速度。未经预处理的蓝藻厌氧发酵初期，发酵液中MC-YR含量有所增加，主要是因为部分蓝藻细胞利用自身数量优势与厌氧生物竞争性生长过程中，仍可释放过量的MC-YR有关。我们的研究表明经碱法热处理后蓝藻发酵后的烘干藻粉中MCs含量远低于世界卫生组织规定的1 μg·kg^-1（或1 μg·L^-1）以下的标准，可安全地做为复合肥的有机质原料，进而促进富营养化水体蓝藻水华的资源化利用，使物尽其用。

4 结论

以蓝藻为原料厌氧发酵制沼气工艺中，蓝藻的分解特性是制约厌氧发酵效率的重要因素。本文采用旋转组合设计法，以蓝藻藻浆的SCODcr为检测指标，研究了碱法热处理工艺中3个主要参数变化对蓝藻特性变化的影响，并通过对比实验研究了预处理对厌氧发酵产气和微囊藻毒素含量变化的影响，主要结论如下：

（1）依据碱用量、热处理温度及处理时间对蓝藻藻浆SCODcr变化的影响实验，构建了三次多项式数学模型（R²=0.983 9），此模型可以对碱法热预处理对蓝藻的最佳工艺参数和结果进行分析预测。依据模型优化的条件（3%NaOH，78 ℃，热处理5.6 h）预处理蓝藻，藻液SCODcr值为5 446 mg·L^-1，比数学模型预测的SCODcr值（5 479 mg·L^-1）略低。

（2）厌氧发酵实验表明预处理后的蓝藻藻浆累积产气率达到425.4 mL·g^-1 VS，是未处理蓝藻产气率的4.72倍。

（3）MCs检测结果显示，预处理后的实验组MCs降解速度更快且终浓度低，远远低于世界卫生组织公布规定的MCs上限标准，同时发现藻毒素MC-RR比MC-YR更容易降解。

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