EVALUACIÓN DEL EFECTO DE PRE-TRATAMIENTO CON ULTRASONIDO EN LA EXTRACCION DE FLAVONOIDES CONTENIDOS EN LAS CASCARAS DE CÍTRICOS/EVALUATION OF THE EFFECT OF PRE-SONICATION IN EXTRACTING FLAVONOIDS IN CITRUS PEELS

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RESUMEN

Antecedentes. Los flavonoides son polifenoles que se encuentran comúnmente en frutas y vegetales, se pueden encontrar en forma libre o unida a azúcares formando heterópsidos; la identificación, cuantificación y extracción de estos compuestos ha despertado un gran interés debido a que se ha reportado que poseen diversas propiedades benéficas para la salud del ser humano y la industria alimentaria. Objetivo. Evaluar el efecto del pre-tratamiento con ultrasonido (US) en la extracción de flavonoides contenidos en las cascaras de cítricos. Métodos. Las muestras (cascara de la naranja, limón y mandarina) fueron expuestas a pre-tratamiento con US a 45 KHz a una temperatura de 30, 40 y 60 °C durante 30, 40 y 60 minutos y se sometieron a extracción sólido-líquido (etano al 96%/80°C/40 min.); la solución obtenida se llevó a espectrofotometría para leer su absorbancia a 258 nm, la identificación de flavonoides se llevo a cabo por las pruebas con NaOH al 10% y Shinoda. Resultados. Evidenciaron diferencia significativas (p>0.05) al comparar las muestras tratadas con US y la control (cascara sin exposición a US), al mostrar un incremento del 60% en la extracción de flavonoides las tratadas a 45 KHz/60°C/60 min; debido probablemente al efecto de cavitación; que provocan macro turbulencia y la colisión de interpartículas de la biomasa que acelera difusión del soluto en la fase solida al solvente. La identificación de metabólitos secundarios en el extracto acuoso presentó resultado positivo para flavonoides, lo que indica que los ácidos carboxílicos pueden discriminarse con facilidad, debido a que transfieren cuantitativamente un protón al ion hidroxilo, revelando la presencia de flavononas o isoflavononas. Conclusiones. La extracción acuosa asistida por US es una de las herramientas con mayor perspectiva en la extracción de compuestos bioactivos, por ser un método eficiente, de bajo costo y minimiza los problemas presentados con las técnicas de extracción convencional.

Palabras clave: Ultrasonido, extracción, cítricos, flavonoides, espectrofotometría.

ABSTRACT

Background. Flavonoids are polyphenols which are commonly found in fruits and vegetables, they can be found in free or bound form heterópsidos forming sugars; the identification, quantification and extraction of these compounds has attracted considerable interest because it has been reported to have several beneficial properties for human health and the food industry. Objective. Evaluate the effect of pre-treatment with ultrasound (US) in the extraction of flavonoids contained in citrus peels. Methods. The samples (orange peel, lemon and tangerine) were exposed to pre-treatment with US to 45 KHz at a temperature of 30, 40 and 60°C for 30, 40 and 60 minutes and subjected to solid extraction -liquid (ethane 96% / 80°C /40 min.); The solution obtained was carried spectrophotometer to read absorbance at 258 nm, the identification of flavonoids was carried out by testing with 10% NaOH and Shinoda. Results. Showed significant difference (p>0.05) when comparing the US treated samples and controls (shell without exposure to US), showing an increase of 60% in the extraction of flavonoids treated at 45KHz/60°C/60min; probably due to cavitation; macro causing turbulence and interparticle collision biomass accelerating diffusion of the solute in the solid phase to the solvent. Identification of secondary metabolites in the aqueous extract showed a positive result for flavonoids, indicating that carboxylic acids can be discriminated easily, because a proton transfer quantitatively to hydroxyl ion, revealing the presence of flavanones or isoflavononas. Conclusions. Assisted by US aqueous extraction is one of the most perspective tools in the extraction of bioactive compounds, as an efficient method, inexpensive and minimizes the problems presented by conventional extraction techniques.

Keywords: Ultrasound, extraction, citrus flavonoids, spectrophotometry.

(ProQuest: ... denotes formula omitted)

INTRODUCCIÓN

En las últimas décadas, el aprovechamiento de residuos (desechos y subproductos) generados en las transformaciones agroindustriales, son de gran importancia entre la comunidad científica y la industria; por no ser utilizados eficientemente, al desconocer su valor adicional y no contar con información que los caracterice. Es así, como se han diseñado procesos para utilizar estos materiales en la generación de productos de alto valor comercial como etanol, enzimas, ácidos orgánicos, aminoácidos y metabólitos secundarios (1).

Los flavonoides son constituyentes de amplia distribución en el reino vegetal, su distribución cuantitativa varía según la planta, explicado por la regulación de la expresión genética y la interacción con factores ambientales (clima, altitud, nutrición y prácticas agrícolas) (1, 2). Los flavonoides presentan una gran variedad estructural, con un esqueleto común de núcleo flavon (2-fenilbenzopirano). En los cítricos, los flavonoides más abundantes son aquellos pertenecientes a los grupos de las flavonas, flavononas, chalconas y dihidrochalconas. Estos compuestos tienen una distribución restringida, lo cual hace que sean descritos como flavonoides minoritarios a pesar de estar presentes en concentraciones significativas en algunos alimentos alto consumo (3).

En general, los flavonoides pertenecen al grupo de los compuestos fenolicos, que han mostrado una amplia variedad de actividades biológicas: antioxidante, antimicrobiana, antiinf lamatoria, inmunomoduladora, antiviral, antiproliferativa, antimutagenica, anticarcinogenica, acciones vasodilatadoras, y prevención de enfermedades coronarias y desordenes neurodegenerativos (4, 5).

Las técnicas clásicas para la extracción del material crudo de frutas y verduras están basadas en la correcta elección del solvente acoplado con el empleo de calor y/o agitación, esta técnica puede ser mejorada por la utilización del US; produciendo efectos mecánicos por una mayor penetración del solvente en la materia celular mejorando la transferencia de masas (6, 7). El US puede ser el método más simple para extraer los componentes intracelulares como son: enzimas, endotoxinas, polisacáridos, proteínas y partículas subcelulares, causado por el efecto de cavitación (8).

El objetivo de esta investigación fue evaluar el efecto del pre-tratamiento con ultrasonido a 40 KHz a una temperatura de 30, 40 y 60°C durante 30, 40 y 60 minutos en la extracción de flavonoides contenidas en las cascaras de cítricos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Acondicionamiento del material vegetal El trabajo se llevó a cabo utilizando cascaras de naranja, limón y mandarina, adquiridas en el mercado local.

Tratamiento con ultrasonido

Se empleó un equipo Branson 1510 (40 KHz) y como medio de transmisión agua desionizada, se establecieron 12 tratamientos que se describen en la tabla 1 (24, 25, 26, 27, 28).

Tipo de extracción sólido-líquido

Se realizaron extracciones sólido-líquido de las cascaras de los cítricos (Limón, mandarina y naranja) en etanol al 96% en una relación constante producto: disolvente de 1:100 (p/p), a presión atmosférica y en baño termostatado a 80&degC durante 40 min (9).

Determinación del porcentaje de Flavonoides por UV/VIS

Los extractos metanólico concentrados, se diluyeron en 10 mL de MeOH y se llevaron a 100 mL (solución madre). Como solución patrón se utilizó 0.0445g de quercetina en 100 mL de MeOH, estas soluciones se leyeron a una absorbancia de 258 nm en un espectrofotómetro UV/Vis (10, 11). Se empleó la siguiente expresión para la determinación del contenido total de flavonoides expresados como quercetina (12):

... (Ecuación 1)

Dónde: X: contenido de flavonoides totales como quercetina (%). Am: absorbancia de la solución muestra (nm). PR: peso de la sustancia de referencia (g). AR: absorbancia de la solución de referencia (nm)

Identificación de flavonoides

Prueba con NaOH al 10 %: Se tomaron 5 mL del extracto concentrado y mezcló con 1 mL de NaOH al 10% (13).

Prueba de Shinoda: Se tomaron 5 mL del extracto concentrado, se le agregó limaduras de magnesio o zinc en polvo y 1 mL de ácido clorhídrico concentrado (13).

Análisis estadístico. Los resultados obtenidos fueron tratados estadísticamente a través de análisis de varianza (??=0.05) y con el fin de discernir mejor los resultados del ANOVA se utilizó la prueba post hoc de Diferencias Mínimas Significativas (DMS). Los anteriores análisis fueron efectuados utilizando el paquete de software estadístico SPSS versión 19.0.

RESULTADOS

En la figura 1, se muestran los resultados del porcentaje de extracción de flavonoides de cascaras de cítricos (Limón, mandarina y naranja).

DISCUSIÓN

Como se puede observar en la figura 1, los resultados obtenidos con extracción convencional en las muestras control de cada cítrico, presentan diferencias significativas (p>0.05) con las tratadas con US; la temperatura utilizada (80 y 90°C) no mejoró en ningún caso la extracción, probablemente debido al deterioro e inestabilidad sufrida por los compuestos fenólicos al alcanzar temperaturas de ebullición del extracto (11, 14) y al área de transferencia del solvente en las muestras de cascaras de cítricos, ya que entre más pequeño sea el tamaño de las partículas mayor intercambio ocurrirá (15).

La extracción de flavonoides del material vegetal, depende del tipo y de la polaridad del disolvente (9, 16), en cáscara de cítricos los flavonoides son polares y sus estructuras glicosídicas son solubles en solventes polares (metanol) y menos en compuestos orgánicos no polares (acetona y hexano) (17, 18).

Resultados similares de flavonoides se obtuvieron por extracción asistida con ultrasonido de 24 a 36 mg/g en desechos de pomelo, lo que sugiere su uso con fines económicos y ambientales (19). Otras investigaciones, muestran resultados muy variables respecto a la cantidad de polifenoles obtenidos en cáscaras de otros cítricos: cáscaras del limón (1,9 mg/g), naranja (1,79 mg/g) y pomelo (1,55 mg/g); naranja agria (7,85 mg/g) y la naranja valencia (2,5 mg/g), varían considerablemente; al igual que el limón mexicano (5,73 mg/g) y limón real (3,58 mg/g) (20). Los flavonoides están presentes principalmente en la cáscara y bagazo que, en la pulpa; en general, se considera que los flavonoides mayoritarios son hesperidina y naringina (21).

Los resultados de la extracción de flavonoides con US (40 KHz), evidencio que a mayor temperatura (60°C) y tiempo de exposición (60 min); se presentó un aumento significativo (p>0.05) en el porcentaje de extracción de compuesto. De acuerdo a la figura 1, observamos que en todos los tratamientos realizados el limón es el cítrico que presento mayor contenido de flavonoides totales, seguido de la naranja y la mandarina.

Estos resultados se pueden deber al efecto de cavitación del US, que favorecen la permeabilización de las paredes y membranas celulares; permitiendo una mayor solubilización de los compuestos sólidos en el solvente. El US incrementa los niveles de extracción de componentes fenolicos y otros compuestos (As, Ca, Cd, Co, Cr, Fe, Zn, hidrocarburos, entre otros) en diferentes materiales biológicos (22, 23). Estudios similares sobre extracción asistida con US de flavonoides en alfalfa, determinado que las condiciones ideales de extracción eran: líquido-solido de 57,16 mL, a 40 KHz /60°C/50 min y 52,14 % de etanol, evidenciando su eficiencia (24).

Así mismo, el efecto del US a 35 KHz durante 60 y 90 min en el bagazo de la uva, determinando que a mayor tiempo de exposición se incrementaba significativamente el nivel de extracción de polifenoles totales; debido probablemente a que las ondas generan una vibración en el interior de la estructura del sólido que causa una separación de la estructura celular facilitando la liberación de polifenoles (25, 26).

Resultados similares fueron encontrados al desarrollaron un método utilizando extracción asistida por US (EAU) para la obtención de hesperidina a partir de la cascara de cítricos; expusieron que el tipo de solvente, la frecuencia y la temperatura, fueron las variables que más afectaron positivamente el rendimiento de extracción.

Sin embargo, a diferencia de los resultados obtenidos en este trabajo, estudios previos ponen de manifiesto que a temperaturas mayores de 50°C con extracción asistida por US no mejora el proceso de extracción de fenoles totales en cáscara de cítricos; ya que a temperaturas altas se induce a la inestabilidad de los compuestos fenólicos (27, 28).

La identificación de metabólitos secundarios en el extracto acuoso, con hidróxido de sodio al 10% presentó resultado positivo para flavonoides, ya que el color producido fue rojo suave, lo que indica que los ácidos carboxílicos pueden discriminarse con facilidad, debido a que transfieren cuantitativamente un protón al ion hidroxilo, revelando la presencia de flavononas o isoflavononas (13, 29).

La prueba de Shinoda también presentó un resultado positivo (color rojo magenta), debido a que al poner en contacto la muestra con el ácido clorhídrico y el magnesio metálico forman hidrogeno, que genera por reducción el ion flavilio, confirmando la presencia de flavonoides los cuales son responsables de la coloración en la mayoría de las plantas (15).

CONCLUSIONES

La aplicación de ultrasonido (40KHz/60°C/60 min) como tratamiento previo a la extracción de f lavonoides incrementa significativamente (p>0.05) los niveles de extracción de componentes fenolicos presentes en las cascaras de cítricos; debido probablemente al efecto de cavitación que causa la permeabilización de la pared y membrana celular, facilitando la liberación de polifenoles; alcanzando un incremento del 40% en la extracción de flavonoides, convirtiéndose en una tecnología con grandes perspectiva en la extracción de compuestos bioactivos, por ser un método eficiente, de bajo costo y minimiza los problemas presentados con las técnicas de extracción convencional.

References

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