INFLUENTA ACIDULUI SALICILIC ASUPRA CRESTERII PLANTULELOR DE FLOAREA-SOARELUI (HELIANTHUS SP.) SI ASUPRA ACTIVITATII PEROXIDAZICE A PLANTULELOR

Headnote

THE INFLUENCE OF SALICYLIC ACID ON GROWTH OF SUNFLOWER (HELIANTHUS SP.) PLANTLETS AND ON THE PEROXIDASE ACTIVITY IN THE PLANTLETS. Salicylic acid plays an essential role in the regulation of different physiological processes. In this paper we studied the influence of exogenous Salicylic Acid (SA) solutions, administrated in different concentrations (0.01 mM, 0.1 mM, 1.0 mM or 5.0 mM) on the growth of roots and coleoptiles of sunflower (Helianthus sp.) plantlets, in comparison with the growth of reference lots in plain water, and also the peroxidase activity in the enzyme extract obtained from sunflower plantlets roots and shoots resulted after 3 and 5 days of germination. The obtained results showed that the exogenous salicylic acid influence the growth of sunflower plantlets and the peroxidase activity compared to that of the reference lots, the influences depending on the used concentration.

Keywords: salicylic acid, growth, roots, coleoptiles, peroxidase activity

INTRODUCERE

Acidul salicilic (AS) sau acidul o-hidroxibenzoic, produs al caii fenolpropanoide si a caii shikimatului, este considerat astazi ca fiind o importanta molecula semnal, implicata În derularea proceselor de dezvoltare la plante (Ryan si Farmer, 1998), este un regulator de crestere, care influenteaza multe procese fiziologice, cum ar fi: germinatia (Cutt si Klessig, 1992), Închiderea stomatelor (Larque-Saaveda,1979), permeabilitatea membranelor (Barkonsky si Einhellig, 1993), rata fotosintezei (Khan et al., 2003). In anul 1974, Cleland si Ajami, au demonstrat ca AS are rol de regulator endogen al Înfloririi. Dupa Handro si colab., (1997), AS favorizeaza Înflorirea si tuberizarea la plante. Ei au studiat efectul in vitro al AS asupra Înfloririi Streptocarpus nobilis, dar si asupra tuberizarii in vitro la Ullucus tuberosus. La o concentratie de 0,5-2,0 µM AS adaugat În mediul de cultura numarul mugurilor a crescut si lujerul s-a alungit semnificativ, comparativ cu culturile control lipsite de AS.

Concentratii picomolare de AS pot intensifica cresterea celulara si embriogeneza suspensiilor celulare În culturile in vitro de Coffea arabica, (Quiroz-Figueroa et al. 2001). Autorii citati, au observat o dublare a ratei de crestere a celulelor, comparativ cu culturile netratate. Corelând rezultatele lor cu cele ale altor cercetatori, ei au ajuns la concluzia ca AS poate activa ca un morforegulator, fapt care sustine ipoteza ca AS functioneaza ca un regulator de crestere. Quiroz-Figueroa et al. (2001), au sugerat ca ar fi posibil ca acest compus fenolic sa actioneze ca o molecula semnal În diferentierea celulara, dar este posibila si o alta explicatie si anume, datorita proprietatii AS de a forma chelati, anumiti inhibitori prezenti În culturile celulare pot fi inactivati.

Procesul de generare a radicalilor liberi poate fi minimalizat prin adaugarea AS, care poate chela metalele tranzitionale, reducând astfel producerea radicalilor hidroxil (HO-) sau poate actiona direct ca antioxidant Împotriva acestor tipuri de radical liberi ai oxigenului (Antofie et al., 2003).

Un efect fiziologic direct al AS se datoreaza influentei asupra activitatea enzimelor antioxidante. Unele enzime, cum ar fi guaiacol-peroxidaza si glutation-reductaza, sunt activate de tratamentele efectuate cu solutii de AS iar altele cum ar fi catalaza, sunt inhibate, În uma tratamentelor cu AS, observându-se modificari În amprentele izoenzimelor acesteia, (Horvath et al., 2002). Nu se cunoaste Însa exact daca aceasta inhibitie este specifica doar pentru catalaza sau este valabila În cazul tuturor enzimelor care contin fier În compozitie.

În context cu aceste date de literatura in lucrarea de fata ne-am propus sa studiem influenta AS exogen asupra cresterii plantulelor de floarea-soarelui (Helianthus sp.) si asupra activitatii peroxidazice la nivelul radacinitelor si tulpinitelor acestor plantule.

MATERIAL SI METODE

Material vegetal: Cercetarile au fost efectuate cu material semincer respectiv seminte de floarea-soarelui (NS-H-111 Valentino), având facultatea germinativa de 90%.

În aceasta lucrarea am urmarit În paralel cresterea radacinitelor si a tulpinitei plantulelor de floarea-soarelui si activitatea peroxidazica (AP) a extractelor enzimatice obtinute din acestea, pe parcursul primelor 3 respectiv 5 zile de la punerea semintelor de floarea-soarelui la Încoltit.

Tratamentele au fost aplicate pe loturi de câte 150 de cariopse/proba, Împartite În trei germinatoare.

Germinatia s-a desfasurat În casolete din material plastic, pe un substrat constând din hârtie de filtru, umidificata cu câte 20 ml ;

- apa de robinet, pentru lotul martor,

- solutie de acid salicilic 0.01mM,

- solutie de acid salicilic 0.1mM,

- solutie de acid salicilic 1.0 mM

- solutie de acid salicilic 5.0 mM, aduse la temperatura camerei. Zilnic s-a complectat cantitatea de solutie din casolete la nivelul de 20 ml. Temperatura de germinatie a fost de 20-23°C.

1. Biometrizarea cresterii În lungime ale organelor plantulelor de floarea-soarelui: În primele 6 zile de germinatie, s-a urmarit cresterea În lungime a organelor vegetative ale plantulelor. Datele individuale, privind lungimea radacinitei embrionare, si a coleoptilului au fost prelucrate statistic cu ajutorul testului "t" determinându-se media aritmetica si abaterea standard si, apoi, În functie de acestea s-a calculat coeficientul de variabilitate (dupa Steinbach, 1961). Coeficientul de variabilitate s-a calculat dupa formula:

CV=σ/M x 100

Unde,

σ =abaterea standard

M=media aritmetica

Semnificatie:

0 - 15% - lot omogen, medie reprezentativa

15 - 30% - lot destul de omogen, medie suficient de reprezentativa

>30% - lot cu omogenitate scazuta sau heterogen

2. Determinarea activitatii peroxidazice, s-au recoltat probe din fiecare germinator, la intervale de 72 respectiv 120 de ore de la punerea la Încoltit. Ca metoda de determinare a AP, s-a folosit metoda Hans-Luck (Hans-Luck, 1970), adaptata de Sipos si colab. (2003), o metoda spectrofotometrica de dozare a peroxidazei.

Materialul vegetal (radacinitele si coleoptilele), câte 0,5g pentru fiecare proba, s-au mojarat cu nisip de cuart, bine spalat si sterilizat În prealabil În etuva, la 120°C, timp de o ora. La fiecare omogenat s-a adaugat câte 4ml solutie tampon fosfat, diluat 1:9 cu apa distilata, racita la 4°C.

Probele au fost centrifugate la 6000 rpm, timp de 25 de minute. Supernatantul reprezinta extractul vegetal ce contine peroxidaza supusa dozari. Extractul se pastreaza În frigider, timp de 2 ore pentru stabilizarea si exprimarea activitatii enzimatice. Pentru a determina extinctia probei, În cuva spectrofotometrului s-au pus câte 0,5ml supernatant, 1ml tampon fosfat nediluat, 0,05ml solutie p-fenilendiamina 1% si 0,05 H2O2 3mM. Citirea extinctiilor s-a facut la 1 minut, dupa amestecarea tuturor reactivilor, În acest moment activitatea fiind maxima; citirea spectrofotometrica se face În momentul indicarii la cronometru a duratei de reactie cu spectrofotometrul Specol 11. Pentru fiecare extract s-au efectuat patru determinari.

Rezultatele obtinute la influenta AS asupra activitatii peroxidazice au fost prelucrate statistic folosind testul "t" (student). Valorile probabilitatii s-au determinat din tabele, utilizând valorile distributiei "t" si gradele de libertate GL pe baza carora a fost calculata varianta sirului empiric.

REZULTATE SI DISCUTII

1. Rezultatele obtinute În urma biometrizarii radacinitelor si tulpinitelor plantulelor de foarea-soarelui au fost trecute În tabelul 1 si reprezentate grafic În fig.1. pentru radacinite În si fig. 2. pentru coleoptile.

Datele obtinute pentru cresterea plantulelor lotului martor, lot omogen cu coeficientul de variabilitate <15%, au fost considerate 100% si cu aceste valori s-au comparat rezultatele obtinute pentru cresterea organelor vegetative ale plantulelor obtinute În urma germinarii semintelor de floarea-soarelui În solutii de AS de diferite concentratii. Toate loturile analizate au fost loturi omogene, reprezentative, cu coeficientul de variabilitate < 15%.

In toate cazurile experimentale solutia de AS de concentratie 5.0 mM a inhibat total germinatia semintelor de floarea-soarelui.

1.1. Cresterea medie În lungime a radacinitelor plantulelor de floarea-soarelui

In cea de a 3-a zi de germinare lungimea radacinitelor a crescut nesemnificativ (cu 4.12% fata de lotul martor În cazul utilizarii solutiei de AS 0.01 mM si cu 8.3% În cazul utilizarii solutiei de AS 1.0 mM) dar a crescut foarte semnificativ (cu 126.8% fata de lotul martor) atunci când semintele au fost germinate În solutie 0.1 mM.

Analiza rezultatelor obtinute În cea de a 5-a zi de germinatie a aratat o crestere foarte semnificativa pentru radacinitele plantulelor germinate În solutie de AS 0.01 mM (cu 197.3%, fata de lotul martor) si În solutie de AS 0.1 mM (cu 261.5% fata de lotul martor). Pentru radacinitele germinate În solutie de AS 1.0 mM cresterea a fost semnificativa (cu 31.9% fata de lotul martor).

In cea de a 6-a zi de germinatie rezultatele obtinute au aratat la fel o crestere În cazul celor 3 concentratii de AS utilizate, si anume o crestere foarte semnificativa, cu 206.1% fata de lotul martor pentru solutia de AS 0.01 mM, cu 345% fata de lotul martor pentru solutia de AS 0.1 mM, respectiv cu 48.3% fata de lotul martor În cazul germinarii În solutie de AS 1.0 mM.

1.2. Cresterea medie În lungime a tulpinitelor plantulelor de floarea-soarelui

Rezultatele obtinute În urma masuratorilor efectuate În cea de a 3-a zi de germinatie, au pus În evidenta o crestere nesemnificativa a tulpinitelor plantulelor de floarea-soarelui, cu 3.6% fata de lotul martor pentru germinarea În solutie de AS 0.01 mM si cu 14.5% fata de lotul martor În cazul germinarii În solutie de AS 0.1 mM. La germinarea semintelor În solutie de AS 1.0 mM s-a constatat o scadere distinct semnificativa, cu 49% fata de lotul martor.

In cea de a 5-a zi lungimea tulpinitelor a crescut foarte semnificativ atunci când germinarea s-a facut În solutie de AS 0.01 mM (cu 89.7% fata de lotul martor) respectiv AS 0.1 mM (cu 116% fata de lotul martor) iar În cazul utilizarii solutiei de AS 1.0 mM cresterea a fost semnificativa (cu 30.7% fata de lotul martor).

Masuratorile din cea de a 6-a zi au dovedit o crestere foarte semnificativa (cu 81.9% fata de lotul martor) În cazul germinarii În solutie de AS 0.01mM, respectiv AS 0.1 mM (cu 113.4% fata de lotul martor). Germinarea semintelor În solutie de AS 1.0 mM a produs o crestere nesemnificativa a lungimii medii a tulpinitei (cu 23% fata de lotul martor).

2. Rezultatele determinarilor activitatii peroxidazice a extractului enzimatic obtinut din radacinitele si coleoptilele plantulelor de floarea-soarelui, au fost trecute În tabelul 2 iar figura 3. reda o imagine de ansamblu a diferentelor procentuale Între extinctiile ce reflecta intensitatea AP În 0.5g radacinite si coleoptile ale plantulelor de foarea-soarelui, provenite prin germinatia semintelor de floarea-soarelui În solutii de AS de concentratie 0.01 mM, 0.1 mM, respectiv 1.0 mM timp de 3 si 5 zile de germinatie În comparatie cu acelasi parametru determinat la radacinile si coleoptilele plantulelor martor, la care extinctia a fost considerata 100%.

In cea de a 3-a zi de germinatie activitatea peroxidazica a extractului enzimatic al radacinitei a crescut semnificativ pentru toate solutiile utilizate la germinare, si anume: distinct seminificativ, cu 6.17% fata de lotul martor pentru solutia de AS 0.01 mM, si foarte seminificativ, cu 9.8% fata de lotul martor pentru solutia de AS 0.1 mM respectiv cu 8.27% fata de lotul martor În cazul germinarii semintelor pe hârtie de filtru Îmbibata cu solutie de AS 1.0 mM.

Masurarea extinctiilor extractelor enzimatice În cea de a 5-a zi de germinare a pus În evidenta o crestere foarte seminificativa fata de valorile obtinute pentru lotul martor. In cazul utilizarii solutiei de AS 0.01 mM valoarea a crescut cu 9.6% fata de lotul martor, pentru solutia de AS 0.1 mM cu 21.9% fata de lotul martor si cu 15% fata de lotul martor pentru o solutie de AS de concentratie 1.0 mM.

Spre deosebire de extractele obtinute din radacinite cele din coleoptile au prezentat o scadere a valorii extinctiilor fata de lotul martor. In cea de a 3-a zi de germinare valoarea medie a extinctiilor a scazut distinct semnificativ, cu 3.6% fata de lotul martor, la utilizarea unei solutii de AS 0.01 mM pentru germinare si a scazut foarte semnificativ, cu 6.7% fata de lotul martor cand s-a utilizat pentru germinare o solutie de AS de concentratie 0.1 mM respectiv, cu 10.3% fata de lotul martor atunci când am utilizat pentru germinare o solutie de AS de concentratie 1.0 mM.

Determinarile extinctiilor extractelor enzimatice din coleoptile, dupa 5 zile de germinare, au dovedit deasemenea o scadere a acestor valori fata de valorile obtinute pentru lotul martor. Scaderea a fost foarte semnificativa pentru toate cele 3 solutii de concentratii diferite utilizate, si anume: cu 30.1% fata de lotul martor pentru solutia de AS 0.01 mM, cu 24.1% fata de lotul martor pentru solutia de AS 0.1 mM, respectiv cu 13.5 % fata de lotul martor pentru o solutie de AS 1.0 mM.

CONCLUZII

Acidul salicilic exogen favorizeaza cresterea În lungime a radacinitelor si coleoptilelor palntulelor de floarea-soarelui germinate pe hârtie de filtru Îmbibata cu solutii de AS de concentratie 0.01 mM, 0.1 mM respectiv 1.0 mM. Acidul salicilic 5.0 mM a inhibat total germinatia semintelor de floarea-soarelui.

Extractele enzimatice obtinute din radacinitele plantulelor de floarea-soarelui germinate În solutii de AS de concentratie 0.01 mM, 0.1 mM si 1.0 mM, prezinta o activitate peroxidazica crescuta fata de lotul martor la care germinatia a avut loc pe hârtie de filtru Îmbibata cu apa, iar cea a coleoptilelor prezinta o scadere fata de valoarea obtinuta pentru lotul martor.

References

BIBLIOGRAFIE

ANTOFIE M., CARASAN ME., BREZEANU A., 2003: Salicylic acid effects on two Gardenia Jasminoides cell lines. Acta Horti Bot. Bucuresti, 30:135-145.

BARKOSKY RR., EINHELLIG FA., 1993: Effects of salicylic acid on plant water relationship.Journal of Chemical Ecolology, 19:237-247.

CLELAND FC., AJAMI A., 1974 - Identification of the flower-inducing factor isolated from aphid honey dew as being salicylic acid. Plant Physiol. 54:904-906.

CUTT JR. KLESSIG DF., 1992: Salicylic acid in plants. A changing perspective. Pharmacetical Technology, 16:25-34.

HANDRO W., MELLO CM., MANZANO MA., FLOH ES., 1997: Promotive effects of Salicylic acid. R. Bras. Fisiol.Veg. 9(2): 139-142.

HANS-LUCK, 1970: Methdos of Enzymatic Analysis Verlag Chemie Gmb H. (Ed).Weinheim Bergstr. Academic Press, New york and London.p.885-888.

HORVÁTH E., SZALAI G., PÁL M., PÁLDI E, JANDA T., 2002: Differences between the catalase isozymes of maize (Zea mays L.) in respect of inhibition by various phenolic compounds. Acta Biol Szeged 46 (3-4): 33-34.

KHAN W., PRITHIVIRAJ B., 2003: Photosynthetic responses of corn and soybean to foliar application of salicylates. Journal of Plant Physiology, p. 18

LARQUE-SAAVEDA A., 1979: Stomatal closure in response to salicylic acid treatment. Pflanzenphysiology, 93: 371-375.

QUIROZ-FIGUEROA F., MENDEZ-ZEEL M., LARQUE-SAAVEDA, LOYOLA-VARGAS VM., 2001: Picomolar salicylate levels enhance cell growth and embryogenesis. Plant cell reports 20:679-684.

RYAN CA., FARMER EE, 1992: Oligosaccharide signals in plants: a current assessment. Ann Rev.Palnt Physiol. Molec.Biol., 42:651-674.

STEINBACH, M., 1961, Prelucrarea statistica În medicina si biologie, Edit. Academiei Republicii Populare Române.

SIPOS M.,FLORIS C.,CHIRIAC C., 2003: Activitatea peroxidazica În embrionii si plantulele de grâu (Triticum aestivum L.soiul Turda) rezultate prin germinatia cariopselor submersate, În prealabil, În azot lichid -196°C.Analele Univ. Oradea, Fasc.Biologie, Tom X., 315-320; 333-342