Mayalarin Tanimlanmasinda Kullanilan Ticari Sistemler Tek Basina Yeterli mi?: Bir Olgu Sunumu/Are Commercial Systems Used for the Identification of Yeasts Enough Alone?: A Case Report

Headnote

Özet

Trichosporon türlerine bagli gelisen infeksiyonlar, özellikle immünosüprese hastalarda olmak üzere, tüm dünyada oldugu gibi ülkemizde de artan siklikta görülmektedir. Antifungal tedaviye göreceli olarak daha dirençli olan Trichosporon türlerinde tani ve tedavi açisindan çesitli zorluklar dikkati çekmektedir. Bu tür infeksiyonlarin tedavisinde kullanilacak uygun antifungal ilaçlarin belirlenebilmesi için, maya türlerinin dogru ve hizli tanimlanmasi oldukça önemlidir. Maya türlerinin geleneksel yöntemlerle tanimlanmasi, uzun zaman ve yogun emek gerektirdiginden, son zamanlarda hizli tanimlama saglayan ticari sistemler yaygin olarak kullanilmaya baslanmistir. Bununla birlikte bu ticari sistemlerin dogru tanimlama oranlarinin, sik izole edilen türlerde daha yüksek, nadir türlerde ise daha düsük oldugu bildirilmektedir. Bu yazida, üriner sistem infeksiyonu olan ve idrar kültüründe maya üreyen bir olgunun degerlendirilmesiyle, ticari sistemlerin tanimlamada tek basina yeterliliginin irdelenmesi amaçlanmistir. Kanli agarda ve eozin-metilen mavisi agarinda kültürü yapilan bir idrar örneginde 24 saatte kuru, burusuk, mumsu, pembe renkli maya benzeri koloniler üremistir. Bu koloniler VITEK® 2 (bioMérieux, Marcy l'Etoile, Fransa) sistemiyle Cryptococcus sp. olarak tanimlanmistir. Buna karsilik, mikroskopik ve makroskopik görünümleri, karbonhidrat asimilasyon testi sonuçlari ve üreaz pozitifligi, izole edilen susun Trichosporon asahii oldugunu göstermistir. Susun Clinical Laboratory Standards Institute M27-A3 standardina göre mikrodilüsyon (amfoterisin B, vorikonazol, flukonazol) ve Etest® (AB Biodisk, Solna, Isveç) yöntemleriyle (kaspofungin, anidulafungin) antifungal duyarliligi da belirlenmistir. Sonuç olarak bu olgu sunumu göstermistir ki, klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarinda, biyokimyasal özellikleri esas alan ticari sistemlerle nispeten nadir görülen Trichosporon spp. gibi maya türleri tanimlandiginda, sonuçlarin geleneksel yöntemlerle de dogrulanmasi ve antifungal duyarlilik çalismalarinin yapilmasi gerekmektedir. Klimik Dergisi 2016; 29(2): 96-9.

Anahtar Sözcükler: Cryptococcus sp., Trichosporon asahii, üriner sistem infeksiyonlari, mayalar.

Abstract

Infections developing due to Trichosporon species especially in immunosuppressed patients have started to increase also in our country as well as in the world. Some difficulties have been encountered in identification and treatment of Trichosporon spp. which are relatively more resistant to antifungal treatment. Accurate and rapid identification of yeast species is very important to ensure determination of the appropriate antifungal agent in treating these infections. Due to long time span and intense effort required, determination using conventional methods has recently been replaced by common use of commercial systems allowing rapid identification. However, the commercial systems used to determine yeasts are reported to have higher correct identification rates for frequently isolated species, whereas lower rates for rarer species. In this report, we aimed to address that the commercial systems are enough alone for identification by evaluating a case of urinary tract infection with a positive urine culture yielding yeasts. A urine culture revealed dry, wrinkled, waxy, pink, yeast-like colonies on blood agar and eosin-methylene blue agar after a 24-hour incubation. These colonies were identified as Cryptococcus sp. using VITEK® 2 (bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) system. On the other hand, this isolate had been demonstrated as Trichosporon asahii by microscopic and macroscopic appearance, carbohydrate assimilation test results and urease positivity. Additionally, antifungal susceptibility of isolate was determined using microdilution (amphotericin B, voriconazole, fluconazole) and Etest® (AB Biodisk, Solna, Sweden) methods (caspofungin, anidulafungin) according to Clinical Laboratory Standards Institute M27-A3 standard. In conclusion, this case report demonstrated that there is a need for confirmation of results with conventional methods for determination of rare species such as Trichosporon spp. identified with commercial systems based on biochemical properties, and antifungal susceptibility tests should be performed in clinical microbiology laboratories. Klimik Dergisi 2016; 29(2): 96-9.

Key Words: Cryptococcus sp., Trichosporon asahii, urinary tract infections, yeasts.

Giris

Mantarlara bagli üriner sistem infeksiyonlari (ÜSI) gittikçe artmakta ve özellikle yatan hastalarda yüksek morbidite ve mortaliteye neden olmaktadir (1). Hastalarda, diabetes mellitus, üriner sistem defektleri, kronik böbrek yetmezligi ve nötropeninin bulunmasi, immünosüpresif ajanlarin, genis spektrumlu antibakteriyel ilaçlarin, kortikosteroidlerin kullanimi ve uzun süreli üriner kateterizasyon bu artista önemli rol oynamaktadir (2,3). Mantarlara bagli ÜSI veya fungüri gibi terimler kullanildiginda genellikle Candida türlerinin neden oldugu ÜSI ve kandidüri akla gelmektedir. Cryptococcus neoformans ve Trichosporon asahii gibi mayalarin ve Aspergillus türleri ve Mucorales takiminda bulunan küflerin de ÜSI yapabilecekleri unutulmamalidir (4). Tibbi öneme sahip maya türlerinin dogru ve hizli tanimlanmasi, erken ve uygun antifungal tedavinin seçimi, mayalara bagli infeksiyonlarin sonuçlarinin iyilestirilmesi ve epidemiyolojik açidan önemlidir (5). Mayalarin geleneksel yöntemlerle tanimlanmasi, zaman alici ve emek yogun oldugu için son zamanlarda birçok klinik mikrobiyoloji laboratuvari, hizli tanimlama saglayan ticari sistemleri yaygin olarak kullanmaktadir (6). Bu bildiride, idrar kültüründe maya üreyen bir olgunun degerlendirilmesiyle ticari sistemlerin tanimlamada tek basina yeterliliginin irdelenmesi amaçlanmistir.

Olgu

Bilinen diabetes mellitus öyküsü bulunan 78 yasindaki kadin hasta, Alzheimer hastaligi, dekübitus ülseri ve oral alim bozuklugu nedeniyle takip edildigi ikinci basamak yogun bakim ünitesinden gastrointestinal kanama gelismesi üzerine hastanemiz gastroenteroloji klinigine sevk edilmisti. Kanama stabil hale geldikten sonra altta yatan hastaliklari nedeniyle genel durum bozuklugu devam ettiginden, genel yogun bakim ünitesinde takibine devam edilmisti. Yatisi sirasinda kolistine duyarli Klebsiella pneumoniae'ye bagli kateter infeksiyonu, ventilatörle iliskili pnömoni, kolistine duyarli Acinetobacter baumannii'ye bagli bakteriyemi ve idrar yolu infeksiyonu gibi çesitli infeksiyon tanilariyla kolistin, imipenem, tigesiklin gibi genis spektrumlu antibiyotik tedavileri almisti. Hastanin idrar kültüründe 100 000 koloni/ml maya benzeri üreme olmasi nedeniyle idrar sondasi degistirilerek kontrol kültürü alinmis ve flukonazol tedavisi baslanmisti. Kontrol kültüründe de ayni üremenin saptanmasi üzerine kaspofungin tedavisine geçilmisti. Kaspofungin tedavisinin 48. saatinde alinan idrar kültüründe de üreme izlendi. Ancak tedavi degisikligi yapilamadan hasta genel durum bozuklugu ve eslik eden pnömoni tablosunun kontrol altina alinamamasi gibi ek sistemik nedenlerin de etkisiyle kaybedildi.

Gönderilen idrarin kanli agar ve eozin-metilen mavisi agarindaki kültüründe 24 saatte kuru, burusuk, mumsu, pembe renkli maya benzeri koloniler üredi. Tekrar edilen idrar kültüründe yine ayni etken üredi ve VITEK® 2 (bioMérieux, Marcy l'Etoile, Fransa) ile Cryptococcus sp. olarak tanimlandi. Ancak kolonilerin kuru olmasi nedeniyle Cryptococcus sp. olamayacagi düsünülerek, Sabouraud dekstroz agarina (SDA) (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, Birlesik Krallik) pasaj yapildi. SDA'da 24 saatte kuru, burusuk, mumsu, krem renginde maya benzeri koloniler üredi (Resim 1A). Germ tüp testi negatifti. Misir unlu Tween® 80 agarinda lam kültüründe gerçek hifler ve tek hücreli, kübik görünümlü artrokonidyumlar görüldü (Resim 1B). Üreaz testi pozitif sonuç verdi. API® 20 C AUX (bioMérieux, Marcy l'Etoile, Fransa) ile glikoz, 2-keto-D-glukonat, arabinoz, ksiloz, N-asetil-D-glikozamin ve selobiyozun pozitif, diger karbonhidrat testlerinin negatif oldugu görüldü. Mikroskopik ve makroskopik görünümüne, karbonhidrat asimilasyon testlerine ve üreaz pozitifligine göre sus T. asahii olarak tanimlandi. Susun DNA dizi analizleri özel bir laboratuvarda (RefGen, Ankara, Türkiye) çalisildi. Dizi analizi verileri, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) sistemi (7) kullanilarak analiz edildi ve T. asahii ile %100 uyumlu bulundu. Susun antifungal duyarliligi, Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 standardina (8) göre mikrodilüsyon (amfoterisin B, vorikonazol, flukonazol) ve Etest® (AB Biodisk, Solna, Isveç) yöntemleriyle (kaspofungin, anidulafungin) belirlendi. Kontrol susu olarak C. albicans ATCC 90028 kullanildi. Amfoterisin B, vorikonazol, flukonazol, kaspofungin ve anidulafungin için minimum inhibitör konsantrasyon (MIK) degerleri sirasiyla 0.25 µg/ml, 0.125 µg/ml, 8 µg/ml, >32 µg/ml ve >32 µg/ml olarak bulundu.

Irdeleme

ÜSI, hastanede yatan hastalarda en sik görülen infeksiyondur. ÜSI'den genellikle bakteriler sorumlu olmakla birlikte, infeksiyonlarin %10'unda fungal etkenler saptanmaktadir (9). Bunlar arasinda, ilk sirada Candida türleri yer almakla birlikte; Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula spp., T. asahii, Saprochaete capitata ve nadiren de Blastomyces dermatitidis, C. neoformans gibi türler de etken olabilmektedir (10). Yapilan çalismalar; yogun bakim ünitesinde yatis, diabetes mellitus, nörojenik mesane, böbrek nakli, malnütrisyon, immünosüpresif ajan veya genis spektrumlu antibiyotik kullanimi öyküsünün, üriner sonda varliginin ve kadin cinsiyetin mantarlara bagli ÜSI ile iliskili oldugunu göstermektedir (9,11). Yetmis sekiz yasindaki kadin olgumuzda da risk faktörleri olarak; yogun bakim ünitesinde uzun süre yatis, diabetes mellitus, malnütrisyon ve genis spektrumlu antibiyotik kullanimi öyküsü vardi.

Mayalarin antifungal ajanlara duyarliliklari degiskendir. Antifungal duyarlilik sonuçlari zaman gerektiren testler oldugu için, mayalarin tür düzeyinde dogru ve hizli tanimlanmasi, hastaya klinik yaklasimi etkilemektedir (12). Mayalarin geleneksel yöntemlerle tanimlanmasi, zaman, yogun emek, egitimli personel ve donanimli laboratuvar gerektirdigi için, günümüzde klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarinda mayalarin tanimlanmasinda genellikle hizli tanimlama saglayan ticari sistemler kullanilmaktadir (5,13). Bu amaçla en yaygin kullanilan sistemler, VITEK® 2 otomatize sistemi YST maya tanimlama karti ve API® 20 C AUX sistemidir (14). VITEK® 2 sisteminin kullaniminin basit olmasi, mikolojiye özgü deneyim gerektirmemesi ve 18 saat gibi bir sürede hizli sonuç vermesi avantajli yönleridir. Ticari sistemler arasinda referans yöntemi olarak kabul edilen API® ile sonuçlarin alinmasi daha uzun (48-72 saat) sürmektedir. API® sistemini degerlendirirken bulanikliga ilaveten hif olusturma özelliklerinin de degerlendirilmesi nedeniyle, Candida glabrata basta olmak üzere, tür tanimlanmasinda VITEK® sistemine göre daha basarili bulunmustur (5,13,14). Bu bildiride de VITEK® 2 otomatize sistemiyle Cryptococcus sp. olarak tanimlanan izolat, geleneksel yöntemler ve API® 20 C AUX sistemiyle T. asahii olarak tanimlanmistir. Olgumuzda etken tanimlanmasindaki güçlükler ve sürecin uzamasi optimal tedavi yaklasimi önünde engel olusturmustur.

Karabiçak ve arkadaslari (5), VITEK® ve API® sistemlerinin, sik karsilasilan türlerde dogru tanimlama oranlarinin daha yüksek (en az %95), nadir görülen türlerde ise daha düsük oldugunu bildirmislerdir. Morfolojik ve fizyolojik tanimlamanin referans alindigi ayni çalismada, C. neoformans olarak tanimlanan bir sus, VITEK® sistemiyle C. neoformans olarak dogru tanimlanmis, API® sistemiyle tanimlanamamis, diger bir C. neoformans susu; VITEK® sistemiyle Cryptococcus albidus olarak yanlis, API® sistemiyle C. neoformans olarak dogru tanimlanmistir. Meletiadis ve arkadaslari (15), üç ticari maya tanimlama sistemini karsilastirdiklari çalismada, ticari sistemlerin performansinin sik görülen türlerde VITEK® ile %92, API® ID32C ile %94, Auxacolor® (Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) ile %95 olmak üzere daha yüksek, nadir görülen türlerde ise daha düsük (VITEK® %64, API® ID32C %56, Auxacolor® %43) oldugunu bildirmislerdir. Moleküler yöntemlerle Cryptococcus gattii olarak tanimlanan üç sus, her üç sistemle de yanlis (C. neoformans) olarak tanimlanmistir. C. neoformans olarak tanimlanan 28 susun degerlendirmesinde, VITEK® sistemi bir izolati tanimlayamamis, API® ID32C sistemi iki susu C. albidus olarak yanlis tanimlamis, fakat Auxacolor® sistemiyle tüm suslar dogru olarak tanimlanmistir. Ayni çalismada T. asahii olarak tanimlanan iki sus, her üç ticari sistemle de dogru olarak saptanmistir. Bizim olgumuzda ise VITEK® sistemiyle Cryptococcus sp. olarak tanimlanan maya türü geleneksel yöntemlerle T. asahii olarak belirlenmistir.

Trichosporon türleri antifungal tedaviye göreceli olarak dirençli mantarlar oldugu için dogru tanimlanmalari önemlidir ve in vitro amfoterisin B'ye direnç gösterebilirler (16). Girmenia ve arkadaslari (17) Trichosporon infeksiyonu olan 55 hastanin, amfoterisin B ile tedavi sonuçlarini degerlendirmisler; hastalarin sadece 13 (%23.6)'ünde tedavide basari saglanabildigini belirtmislerdir. Yildiran ve arkadaslari (18) 27 haftalik prematüre bir yenidoganin kan ve idrar kültürlerinden T. asahii'yi izole etmisler ve hastanin amfoterisin B ile basarili bir sekilde tedavi edildigini bildirmislerdir. Triazol grubu antifungaller, Trichosporon infeksiyonlarinin tedavisinde tercih edilen ilaçlardir. T. asahii suslarinda, flukonazolün in vitro en düsük, vorikonazolün de in vitro en yüksek aktivite gösteren ve en düsük MIK degerlerine sahip triazol grubu antifungaller oldugu bildirilmektedir (16,19). Ekinokandin grubu antifungal ilaçlarin, Trichosporon türlerinde in vitro sinirli ve yetersiz aktivite gösterdigi ve bu ilaç grubuyla tedavi altindayken Trichosporon infeksiyonlarinin gelisebildigi bildirilmistir (16,20). Olgumuzda da kaspofungin tedavisine ragmen T. asahii üremesi saptanmis ve bu susun amfoterisin B, vorikonazol, flukonazol, kaspofungin ve anidulafungin için MIK degerleri sirasiyla 0.25 µg/ml, 0.125 µg/ml, 8 µg/ml, >32 µg/ml ve >32 µg/ml olarak bulunmustur.

Sonuç olarak, mayalarin tanimlanmasinda kullanilan ticari sistemlerin tanimlama oranlarinin sik izole edilen türlerde daha yüksek, nadir türlerde daha düsük oldugu bildirilmektedir. Bu olgu sunumuyla klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarinda, biyokimyasal özellikleri esas alan ticari sistemlerle nadir görülen türler tanimlandiginda, sonuçlarin geleneksel yöntemlerle dogrulanmasi ve antifungal duyarlilik çalismalarinin da yapilmasi gerektigi sonucuna varilmistir.

Çikar Çatismasi

Yazarlar, herhangi bir çikar çatismasi bildirmemislerdir.

References

Kaynaklar

1. Sun W, Su J, Xu S, Yan D. Trichosporon asahii causing nosocomial urinary tract infections in intensive care unit patients: genotypes, virulence factors and antifungal susceptibility testing. J Med Microbiol. 2012; 61(Pt 12): 1750-7.

2. Achkar JM, Fries BC. Candida infections of the genitourinary tract. Clin Microbiol Rev. 2010; 23(2): 253-73.

3. Atalay MA, Koç AN, Sav H, Demir G. Yatan hastalarin idrar kültürlerinden izole edilen Candida türleri ve antifungal duyarliliklari. Türk Hijyen Den Biyol Derg. 2013; 70(4): 185-90.

4. Kaufmann CA. Diagnosis and management of fungal urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 2014; 28(1): 61-74.

5. Karabiçak N, Uludag Altun H, Karatuna O, et al. Mikrobiyoloji laboratuvarlarinda maya türlerinin tanimlanmasinda sik kullanilan ticari sistemlerin degerlendirilmesi: çok merkezli bir çalisma. Mikrobiyol Bül. 2015; 49(2): 210-20.

6. Graf B, Adam T, Zill E, Göbel UB. Evaluation of the VITEK 2 system for rapid identification of yeasts and yeast-like organisms. J Clin Microbiol. 2000; 38(5): 1782-5.

7. Basic Local Alignment Search Tool [Internet]. Bethesda MD, USA: National Center for Biotechnology Information [erisim 20 Subat 2016]. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.

8. Clinical Laboratory Standards Institute. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Approved Standard. 3rd ed. CLSI document M27-A3. Wayne, PA: CLSI, 2008.

9. Nayman Alpat S, Özgünes I, Ertem OT, et al. Kandidürisi olan hastalarda risk faktörlerinin degerlendirilmesi. Mikrobiyol Bül. 2011; 45(2): 318-24.

10. Kauffman CA1, Fisher JF, Sobel JD, Newman CA. Candida urinary tract infections-diagnosis. Clin Infect Dis. 2011; 52(Suppl. 6): S452-6.

11 . Paul N, Mathai E, Abraham OC, Michael JS, Mathai D. Factors associated with candiduria and related mortality. J Infect. 2007; 55(5): 450-5.

12. Freydiere AM, Guinet R, Boiron P.Yeast identification in the clinical microbiology laboratory: phenotypical methods. Med Mycol. 2001; 39(1): 9-33.

13. Borman AM, Szekely A, Palmer MD, Johnson EM. Assessment of accuracy of identification of pathogenic yeasts in microbiology laboratories in the United Kingdom. J Clin Microbiol. 2012; 50(8): 2639-44.

14. Hata DJ, Hall L, Fothergill AW, Larone DH, Wengenack NL. Multicenter evaluation of the new VITEK 2 advanced colorimetric yeast identification card. J Clin Microbiol. 2007; 45(4): 1087-92.

15. Meletiadis J, Arabatzis M, Bompola M, et al. Comparative evaluation of three commercial identification systems using common and rare bloodstream yeast isolates. J Clin Microbiol. 2011; 49(7): 2722-7.

16. Hazirolan G. Trichosporon asahii ve enfeksiyonlarina genel bakis. Mikrobiyol Bül. 2012; 46(4): 707-15.

17. Girmenia C, Pagano L, Martino B, et al. Invasive infections caused by Trichosporon species and Geotrichum capitatum in patients with hematological malignancies: a retrospective multicenter study from Italy and review of the literature. J Clin Microbiol. 2005; 43(4): 1818-28.

18. Yildiran A, Kücüködük S, Saniç A, Belet N, Güvenli A. Disseminated Trichosporon asahii infection in a preterm. Am J Perinatol. 2003; 20(5): 269-71.

19. Colombo AL, Padovan AC, Chaves GM. Current knowledge of Trichosporon spp. and trichosporonosis. Clin Microbiol Rev. 2011; 24(4): 682-700.

20. Bayramoglu G, Sonmez M, Tosun I, Aydin K, Aydin F. Breakthrough Trichosporon asahii fungemia in neutropenic patient with acute leukemia while receiving caspofungin. Infection. 2008; 36(1): 68-70.