PSEUDOMONAS SYRINGAE SSP. SAVASTANOI (Smith, 1908), PROUZROKOVAC RAKA OLEANDERA/PSEUDOMONAS SYRINGAE SSP. SAVASTANOI (Smith, 1908) THE CAUSAL AGENT OF OLEANDER KNOT

Headnote

Izvod

U radu su prikzani rezultati i metode prou£avanja morfoloSkih i biohcmijskih karakteristika bakterije Pseudomonas syringae ssp. savastanoi, prouzrokovaca raka oleandera.

KljuSne rijeci: oleander, Pseudomonas syringae ssp. savastanoi. morfoloske osobine, odgajivacke osobine, biohemijske osobine.

Abstract

Results of the study reffered to the morphological and biochemical characteristics of bacteria Pseudomonas syringae ssp. savastanoi. the causal agent of oleander knot.

Key words: oleander, Pseudomonas syringae ssp. savastanoi. morphological characteristics, breeding characteristics, biochemical characteristics.

UVOD

Nerium oleander L. (oleander) je kod nas jako rasprostranjen u priobalnom pojasu, ali se moze naci i na teritoriji Podgorice. Ova vrsta je znacajna kao ukrasna biljka, srece se u mnogim parkovima, ali se moze slobodno razvijati u prirodi, van parkovskih povrSina, formirajuci ciste sastojine (Popovic i SterniSa, 1971).

Oleander je biljka podlozna napadu mnogih patogena. Kao najznaiajnija i ekonomski najstetnija bolest izdvaja se rak oleandera. Prouzrokovac ove bolesti je bakterija Pseudomonas syringae ssp. savastanoi (Smith).

Bolest je veoma rasprostranjena i moze se sresti skoro svuda gdje se gaji oleander. Prisutna je u Evropi, Mediteranu i Sjevemoj Africi (Bradbury, 1986), a konstatovanaje i na Cmogorskom primorju (Arsenijevic, 1988).

Prema podacima Tehabsim et al. (1991), Caponero et al. (1995), Pyrowolakis & Weltizien (1974), Lavermicocca & Surtco (1987) ovaj patogen izaziva slifine promjene na maslini i jasenu. Prema istrazivanjima koja su vrsena u Holandiji (Arsenijevii, 1988) proizilazi da se bakterije prouzrokovaci patoloskih promjena na jasenu, oleanderu i maslini razlikuju samo u pogledu patogenosti, dok se u pogledu morfoloSkih, biohemijskih, fiziologkih i seroloSkih osobina gotovo potpuno podudaraju. Na osnovu razlika u pogledu patogenosti, P. s. ssp. savastanoi ima tri patovara: P. s. ssp. savastanoi pv. oleae - parazita Olea europea L. (maslina) i raznih vrsta porodice Oleacea, P. s. ssp. savastanoi pv. nerii - parazita Nerium oleander L. (oleander); P. s. ssp. savastanoi pv. fraxini - parazita Fraxinus excelsior L. (jasen) i Olea europea L.

S obzirom na prisustvo bolesti na velikom broju biljaka i sadnica oleandera u Crnoj Gori, pristupili smo prvo testiranju patogenosti, a zatim ispitivanju morfoloskih, odgajivaikih i biohemijsko-fizioloskih osobina bakterije, izolovane iz tumoralnih izrastaja graniica i listova oleandera. Uzorci su sakupljeni oktobra 2002. godine na teritoriji Podgorice i Crnogorskog primorja.

MATERIJAL I METODE

Istrazivacki rad obavljen je na Poljoprivrednom fakultetu u Zemunu, u laboratoriji Katedre za fitopatologiju. Kflo pocetni materijal za izolaciju bakterije korisceno je lisce i gran£ice oleandera na kojima su uoceni tumori.

Izolovanje bakterije izvrseno je standardnom metodom razmaza kapi macerata pomocu bakterioIoSke petlje, na standardnu mesopeptonsku podlogu (MPP). Nakon inkubacije na temperaturi od 27 °C odabrana je pojedinacna kolonija bakterija i presijana na kosu MPP podlogu. Na ovaj nacin dobijena je cista kultura bakterijskog izolata.

Patogenost proucavane bakterije

Provjera patogenosti izolovane bakterije vrSena je na osnovu hipersenzibilnosti, infiltracijom lisca duvana, koriscenjem suspenzije bakterija koncentracije 107cel/mt. Infiltracija tkiva vrsena je medicinskim spricem.

Osim duvana provjera patogenosti vrsena je jos inokulacijom listova i grancica oleandera. Inokulacije su izvrSene prethodnim povredivanjem grancica i listova, pa prskanjem suspenzijom bakterija koncentracije 108cel/ml.

Proucavanje morfoloskih, odgajivackih i biohemijsko'fizioloskih osobina bakterije vrsena su standardnim metodama (Arsenijevic, 1992, Sulic i Panic, 1969, Lelliot & Stead, 1987).

Bakterioloske karakteristike

Razvoj bakterija na vjeStackoj podlozi pracen je posmatranjem izgleda. boje, velicine i oblika kolonija na mesopeptonskoj, King-ovoj podlozi B i podlozi obogacenoj saharozom (NAS). Od tecnih podloga koriscene su hranljivi bujon, Fenni i Cohn. U teCnim podlogama pracene su sljedece odlike: stepen zamucenosti, formiranje taloga, praraenova, obla£ica i promjena boje. Sve podloge su zasijavane jednodnevnom bakterijskom kultuvom.

Razlikovanje bakterija po Gramu obavljeno je koriScenjem 3% KOH (Arsenijevic, 1988).

Prilikom proucavanja biohemijsko-fizioloskih osobina koriScen je tzv. LOP AT test (Arsenijevic, 1988, Klement et. al, 1990), karakteristican za predstavnike roda Pseudomonas. LOP AT test obuhvatio je ispitivanje sljedecih reakcija: stvaranje levana (prati se pojava na MPP podlozi sa 5% saharoze), aktivnost oksidaze, trulez krtola krompira, metabolizam arginina i hipersenzibjlna reakcija na duvanu.

Od ostalih biohemijskih odlika proucene su sljedece: fermentacija ugljenikovih jedinjenja (kao ugljenikova jedinjenja korisceni su seceri: laktoza, dekstroza, saharoza, maltoza i manoza, a od glukozida eskulin); hidroliza skroba; hidroliza zelatina; stvaranje amonijaka; stvaranje vodonik-sulfida; stvaranje indola; redukcija nitrata; aktivnost katalaze; tolerantnost prema 2% i 5% NaCl i reakcije u mlijeku (obrano mlijeko, mlijeko sa metilenskim plavim i mlijeko sa purpurnim brom-krezolom).

REZULTATII DISKUSIJA

Patogenost proufavane bakterije

Sojevi bakterije prouzrokuju hipersenzibilnu reakciju na liScu duvana. Prve promjene na inokulisanom li§cu duvana uo£avaju se dosta brzo, vec poslije 8-10 Casova od ubrizgavanja suspenzije u lisno tkivo. P°Cetne promjene manifestuju se blagim gubljenjem turgora inokulisanog tkiva. Jasne promjene nastale su nakon 24-48 casova, kada su se na inokulisanom liscu javile tipicne nekrotiine promjene. Inokulisano tkivo u pocetku je bilo manje-vice sivo, a kasnije svijetlo-mrko do mrko.

Na inokulisanim biljkama oleandera, 15 dana nakon vjeStacke inokulacije, pojavili su se tumori velicine 2-3 mm, prvo na gran&cama, pa onda na ligcu. Njihov izgled i boja ukazuje na razvoj tipiinih simptoma bolesti koja nastaje u prirodi u uslovima spontane zaraze.

Bakterioloske karakteristike

Proucavana bakterija ima stapicast oblik, gramnegativna je i asporogena.

Na mesopeptonskoj podlozi bakterija je formirala zuckasto-bijele, sjajne, glatke, blago ispup£ene, tadkaste kolonije, precnika 1-3 mm, sto su prema podacima Arsenijevica (1992) i Lelliot-a & Stead-a (1987) karkteristike bakterija roda Pseudomaonas.

Konstatovano je da bakterija na King B podlozi intenzivno formira kolonije zuckastobijele boje, koje posmatrane pod ultravioletnim svjetlom imaju plavidastozeleni sjaj, Sto je dokaz da bakterija luci pigment fluorescin i da spada u grupu fluorescentnih bakterija roda Pseudomonas (Arsenijevic, 1992, Klement et al., 1990, Kiraly et al., 1974). Takode je konstatovan umjeren razvoj bakterije na kosoj MPP, a kod uspravne MPP podloge bakterija se razvijala i na povrsini i duz uboda, sto dokazuje da je bakterija fakultativni anaerob (Sutic i Panic, 1969). Od tecnih podloga pozitivne reakcije su se javile u hranljivom bujonu i Fermi-ju, dok u podlozi Kohn nije doslo ni do kakvih promjena,

Na osnovu reakcija LOPAT testa potvrdeno je (Lelliot-a & Stead-a, 1987) da bakterija pripada lb grupi roda Pseudomonas. Naime, koriscenjem pet osnovnih reakcija ovog testa, dobili smo sljedece rezultate: -+, sto zna£i da proucavana bakterija ne stvara levane na MPP podlozi sa dodatkom 5% saharoze; ne posjeduje ferment oksidazu; na inokulisanim kriskama krompira ne izaziva nikakve promjene; ne posjeduje ferment arginin-dehidrolazu koji razlaze arginin i izaziva hipersenzibilnu reakciju na duvanu.

U tabeli 1. prikazani su rezultati ispitivanja biohemijskih karakteristika bakterije Pseudomonas syringae ssp. savastanoi i poredenje sa literaturnim podacima.

U biohemijskom pogledu, bakterija P. s. ssp. savastanoi izvrsila je fermentaciju nekih ugljenikovih jedinjenja. Promjenom boje indikatora u podlozi koja je sadrzala saharozu i manozu, ustanovljeno je da bakterija razlaze ove Secere do kiseline, a na osnovu pojave mjehurica konstatovano je da je izvrsila i dalje razlaganje kiseline do ugljen-dioksida i vode. Bakterija je izvrSila i fermentaciju laktoze, ali samo do kiseline, dok kod dekstroze i manoze nisu uotene nikakve promjene.

Utvrdivanju biohemijskih osobina doprinijeli su rezultati biohemijskih testova. Tako je utvrdeno da dobijeni izolati vrse hidrolizu skroba, tj. da stvaraju prostija ugljenikova jedinjenja pod uticajem fermenata. Konstatovano je da bakterija lu£i ferment katalazii, kada se dio bakterijske kolonije homogenizuje u 1 ml 20% H2OT. Pozitivnu reakciju n ovom slucaju oznachva pojava mjehurica gasa nastala zbog oslobadanja kiseonika, odnosno ukazuje na prisustvo fermenta katalaze u ispitivanoj kulturi. Bakterija sadrzi i ferment koji LI peptonskoj podlozi triptofan razlaze do indola, na sta je ukazala pojava roze prstena na povrsini podloge. Utvrdeno je da bakterija ne posjeduje ferment zelatinazu.

Reakcije: redukcija nitrata, hidroliza eskulina i stvaranje vodonik-sulfida dale su negativne rezultate, Sto je prema Arsenijevicu (1988) i Lelliot-u & Stead-u (1987) karakteristika bakterije P. s. ssp. savastanoi.

Kao vazan podatak za potpuniju identifikaciju bakterije posluzili su rezultati reakcija u mlijeku. Uoceno je da ova bakterija izaziva i koagulaciju (grusanje) mlijeka i peptonizaciju (prosyjetljavanje) mlijeka, Koagulacija je konstatovana kod obranog, mlijeka sa metilenskim plavim i mlijeka sa purpurnim brom krezolom. Kod mlijeka sa metilenskim plavim doslo je do promjene boje u bijelu, dok je kod mlijeka sa purpurnim brom krezolom konstatovana promjena u maslinastozelenu boju.

Bakterija je pokazala tolerantnost prema 2% i 5% NaCl. I u jednom i u drugom rastvoru doslo je do umjerenog razvoja bakterije.

ZAKLJUCAK

Poredenjem rezultata istrazivanja koji se odnose na testiranje patogenosti. ispitivanje morfoloskih i biohemijskih osobina izolovane bakterije sa podacima drugih autora, zakljuceno je da patogen izolovan iz tumora gramiica i listova oleandera pripada vrsti Pseudomaonas syringae ssp. savastanoi (Smith).

Bakterija proizvodi fluorescentni pigment na King B podlozi, sto ukazuje na to da patogen pripada grupi fluorescentnih bakterija roda Pseudomonas.

U cilju prou£avanja porasta kolonija na razliCitim podlogama dobili smo sljedece rezultate: bakterija formira koionije na MPP i Fermi podlozi,, a ne formira na MPP podlozi sa dodatkom 5% saharoze i Cohn podlozi.

Rezultati LOP AT testa su sljedeci: -+, sto znaci da bakterija ne stvara levane, ne posjeduje ferment oksidazu, ne izaziva trulez krtola krompira, ne hidrolizuje arginin i izaziva pojavu hipersenzibilne reakcije na duvanu.

Biohemijski testovi pokazuju da svi sojevi bakterije daju negativnu reakciju na hidrolizu eskulina i zelatina, stvaranje HiS, redukciju nitrata, stvaranje kiseline iz dekstroze i maltoze. Pozitivni rezultati dobijeni su u sljedecim reakcijama: aktivnost katalaze, hidroliza skroba, stvaranje indola i arnonijaka, stvaranje kiseline iz saharoze, Iaktoze i manoze, razvoj u 2% i 5% NaCl.

Sidebar

PSEUDOMONAS SYRINGAE SSP. SA VASTANOI (Smith, 1908) THE CA USAL A GENT OF OLEANDER KNOT

Summary

Comparing the results of this survey, which consider patogeniciry, morphological and biochemical characteristics of the isolated bacteria, with date of other scientists, we concluded that pathogen isolated from the bacterial galls from leaves and branches of oleander is Pseudomonas syringae ssp. savastanoi.

Bacteria produces pigments on King's medium B and that indicates that pathogen belongs a group of green-fluorescent pseudomonads.

In order to investigate growth of colonies of bacteria in some media we obtained this results: colonies are present on MPP and Fermi media and colonies are absent from the 5% sucrose nutrient agar and Cohn media.

The results of the LOPAT tests are: -(-, which means that all isolates are non-Ievan, oxidase reaction is negative, potato rot is negative, arginin hydrolysis is negative and hypersensitivity reaction on tabacco is positive.

The biochemical tests shows that all the strains gave a negative reaction for aesculin and gelatin hydrolysis, HiS production, nitrate reduction and acid production from decstrose and maltose. Positive test results were obtained for catalase reaction, scrob hydrolysis, Lndol and NH3 production, acid production from sucrose, lactose, manose and growth in 2% and 5% NaCI.

References

LITERATURA

Arsenijevic, M. (1988): Bakterioze biljaka, Beograd: NauCna knjiga.

Arsenijevic, M. (1992): Fitopatogene bakterije, Beograd: Naucna knjiga.

Bradbury, J.F. (1986): Guide to plant pathogenic bacteria, CAB International Mycological Institute, 173 pp.

Caponero, A., Contesini, A. M., Iacobellis, N. S. (1995): Population diversity of Pseudomonas syringae subsp. savastanoi on olive and oleander, Review of Plant Pathology, voi. 75, No 5, 427 pp.

Ferari, M., Marcon, E., Menta, A., Montermini, A. (1999): Malattie e parassiti delie piante da fiore, omamentali e forestall. Edagricole - Edicione agricole.

Ferraris, T. (1926): Trattato di patologia e terapia vegetale, 3 ed., Milano, 104 - 106. H3paeJi-bCKE>]H, B.n. (1960): BaicrepHa'bHbie 6o.ne3HK pacTeHHH, MocKBa: TocyflapcTBeHoe H3AarejibCTBO cejibCK0X03uffCTBeH0fijiHTepaTypbi, 147- 148.

Klement, Z., Rudolph, K.., Sands, D. C, (1990): Methods in Phytobacteriology, Budapest: Akademia Kiado, 134 - 142.

Kiraly, Z., Klement, Z., Solymosy, F., Voros, J. (1974): Methods in Plant pathology, Akademia Kiado, Budapest.

KojiecHHKOB, A. H. (1974): /hjKopaTHBHaji AeHApo;iornfl, MocKBa: H3flaTebCTBO «JIecHaa npoMbiuuieHHocTb, 524-525.

Lavermicoeca, P., & Surico, G. (1987): Presenca epifitica di Pseudomonas syringae pv. savastanoi e di altri batteri sull olivo e suil oleandro, Phytopathologia Mediteraneae, vol. 26, 136 - 141.

Lelliot, R. A., & Stead, D. E. (1987): Methods for the diagnosis of bactrial diseases of plants, vol. 2, British society for Plant Pathology, 43 - 44

Pascal, P. Pirone. (1978): Diseases & Pests of Ornamental plants, New York: A Wiley - Interscience publication, 370 - 372.

Popovic, D., Stemisa, A. (1971): Flora i vegetacija Hercegnovskog podrucja s posebnim osvrtom na parkovsko bilje, Beograd: Beogradski izdavacko graficki zavod, 137-138.

Pyrowolakis, E., & Weltzien, C. H. (1974): Studies on the distribution of olive knot, induced by Pseudomonas savastanoi (Sm.) Stev. in the Greek island ofCrete, Phytopathologia Mediteranea, No 13, 118 - 120.

Tebabsim, A., Khadair, M. A., Janse, J. D. (1991): Occurence and distribution of Pseudomonas syringae subsp. savastanoi in Jordan, Phytopathologia Mediteranea, vol. 30, 64 - 66.

Suti6, D. (1995): Anatomija i fiziologija bolesnih biljaka, Beograd - Zemun, 21 pp.

Sutic, D., Dowson, W. J. (1962): The reactions of olive, oleander and ash, cross inoculated with some strains and forms of Pseudomonas savastanoi (Smith) Stevens, Phytopathologische Zeitschrift, Bd. 46, Heft4, 305-314,

Sutic, D., Panic, M. (1969): Metode prouSavanja fitopatogenih bakterija, Beograd: Zavod za zaStiru bilja poljoprivrednog fakulteta i Sekretarijat za poljoprivredu, Sumarstvo i vodoprivredu SR Srbije.